【摘要】：【目的】西瓜細(xì)菌性果斑病由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起,是一種嚴(yán)重的世界性病害。細(xì)菌的鞭毛通常被認(rèn)為是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官,在細(xì)菌的侵染過(guò)程中也起重要作用,已有報(bào)道表明這種作用可受鞭毛蛋白基因fliS的調(diào)控,目前西瓜細(xì)菌性果斑病菌鞭毛蛋白基因fliS的功能及其調(diào)控機(jī)理尚不清楚,本研究旨在探討該基因在鞭毛形成和致病性等生物學(xué)特性中的作用�！痉椒ā恳怨卟【吧椭虏【�1號(hào)基因組DNA為模板,設(shè)計(jì)一系列引物,PCR擴(kuò)增敲除基因fliS的上下游片段,通過(guò)回收、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟構(gòu)建敲除載體和互補(bǔ)載體,然后采用三親雜交法,根據(jù)同源重組的原理,構(gòu)建fliS基因缺失突變菌株及其互補(bǔ)菌株,并對(duì)其鞭毛的形態(tài)特征、致病性、過(guò)敏反應(yīng)、游動(dòng)性、群體感應(yīng)、菌膜、生長(zhǎng)速率、菌落形態(tài)等生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定;進(jìn)一步提取細(xì)菌總RNA,以谷氨酰胺合成酶基因glnA為參照來(lái)校正目標(biāo)基因的表達(dá)量,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法,比較野生菌株、敲除菌株和互補(bǔ)菌株部分鞭毛蛋白基因flh D、fliE、fliC、flgK、flgM、fliD和fliA的表達(dá)量差異�！窘Y(jié)果】通過(guò)抗性基因Gm的篩選和PCR驗(yàn)證,成功構(gòu)建了果斑病菌鞭毛蛋白基因fliS缺失突變菌株1-fliS及其互補(bǔ)菌株1-fliShb,并對(duì)所得菌株的生物學(xué)特性和鞭毛進(jìn)行觀察,結(jié)果表明,與野生菌株相比,鞭毛蛋白基因缺失突變菌株的游動(dòng)性、菌膜形成能力減弱,互補(bǔ)后游動(dòng)性、菌膜形成能力基本恢復(fù);缺失突變菌株對(duì)甜瓜、西瓜幼苗以及西瓜果實(shí)的致病性降低,互補(bǔ)后對(duì)西瓜、甜瓜幼苗及西瓜果實(shí)的致病力完全恢復(fù)。電鏡測(cè)試顯示,突變菌株鞭毛變短,長(zhǎng)度約為野生菌株的1/3—1/4,互補(bǔ)后鞭毛合成能力基本恢復(fù),鞭毛長(zhǎng)度約為野生菌的4/5;光學(xué)顯微鏡下,可觀察到在NA平板上的野生菌株菌落周圍有明顯的由細(xì)菌顫泳形成的特殊暈圈,而缺失突變菌株在NA平板上不能形成這種暈圈,互補(bǔ)后暈圈形成能力部分恢復(fù);缺失突變菌株的生長(zhǎng)速率比野生菌株慢,互補(bǔ)后生長(zhǎng)速率沒(méi)有恢復(fù);野生菌株、突變菌株和互補(bǔ)菌株在過(guò)敏性反應(yīng)和群體感應(yīng)方面無(wú)差異。qRT-PCR分析結(jié)果顯示,fliS基因缺失突變后,flh D表達(dá)量較野生菌株明顯降低,fliE、fliC和flgK表達(dá)量較野生菌株明顯升高,flgM和fliD表達(dá)量略微上升,fliA表達(dá)量基本不變;互補(bǔ)菌株中flhD、fliE和fliC表達(dá)量部分恢復(fù),flgK、flgM和fliD表達(dá)量沒(méi)有恢復(fù),與突變菌株相同�！窘Y(jié)論】鞭毛基因fliS對(duì)果斑病菌鞭毛絲的形成、游動(dòng)性、菌膜形成能力、生長(zhǎng)速率、菌落形態(tài)、致病性等均有調(diào)控作用。
[Abstract]:[objective] the bacterial fruit spot of watermelon is caused by Acidovorax citrulli,Ac, which is a serious worldwide disease. The flagella of bacteria is generally considered to be the motility organ of bacteria and plays an important role in bacterial infection. It has been reported that this action can be regulated by the flagellin gene fliS. At present, the function and regulation mechanism of flagellin gene fliS in bacterial fruit spot pathogen of watermelon are not clear. The purpose of this study was to investigate the role of the gene in the biological characteristics of flagella formation and pathogenicity. [methods] A series of primers were designed based on the genomic DNA of wild type pathogenic bacteria strain 1. The upstream and downstream fragments of knockout gene fliS were amplified by PCR. The knockout vector and complementary vector were constructed by recovery, enzyme digestion, ligation and transformation. The mutant strain of fliS gene deletion and its complementary strain were constructed, and the biological characteristics of flagella such as morphology, pathogenicity, hypersensitivity, swimming, colony induction, membrane, growth rate and colony morphology were determined. The total bacterial RNA, was further extracted to correct the expression of the target gene using glutamine synthase gene glnA as the reference, and real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) was used to compare the wild strains. Partial flagellin gene of knockout strain and complementary strain were differentially expressed between the two strains. [results] by screening the resistant gene Gm and verifying by PCR, the expression levels of fliD and fliA were different between the knockout strain and the complementary strain. The mutant strain 1-fliS with flagellin gene fliS deletion and its complementary strain 1-fliShbwere successfully constructed. The biological characteristics and flagella of the strain were observed. The flagellin gene deletion mutant strain had the ability of swimming, the ability of membrane formation was weakened, and the ability of membrane formation was basically recovered after complementation. The pathogenicity of the mutant to melon, watermelon seedling and watermelon fruit was decreased, and the pathogenicity of the mutant strain to watermelon, melon seedling and watermelon fruit was completely recovered after complementation. The results of electron microscopy showed that the flagella of the mutant strain became shorter and the length was about 1 / 3 / 1 / 4 of that of the wild strain, and the flagellum synthesis ability of the mutant was almost recovered after complementation, and the length of the flagella was about 4 / 5 of that of the wild strain. Under the optical microscope, it was observed that there was a special halo circle formed by bacterial fibrillation around the colony of wild strains on the NA plate, but the absent mutant strain could not form the halo circle on the NA plate, and the ability of halo formation was partly recovered after complementation. The growth rate of deletion mutant strain was slower than that of wild strain, but the growth rate did not recover after complementation. There was no difference in allergy and population induction between wild strain, mutant strain and complementary strain. QRT-PCR analysis showed that the expression of, flh D was significantly lower than that of wild strain after fliS gene deletion mutation, and fliE, was significantly lower than that of wild strain. The expression of fliC and flgK was significantly higher than that of wild strain, the expression of flgM and fliD was slightly increased, and the expression of fliA was almost unchanged. The expression of flhD,fliE and fliC was partially recovered in complementary strains, but the expression of flgK,flgM and fliD was not recovered, which was the same as that of mutant strains. [conclusion] flagellum gene fliS can induce flagellum formation, swimming, membrane formation and growth rate. Colony morphology, pathogenicity and so on all have the regulation function.
【作者單位】： 福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院;
【基金】：國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201003066-2) 福建省自然科學(xué)基金(2014J01084) 福建農(nóng)林大學(xué)發(fā)展基金(KF2015058);福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新專項(xiàng)基金(CXZX2016133)
【分類號(hào)】：S436.5

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本文編號(hào)：2375136