【摘要】：本研究旨在建立豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)CH-HuN1301株N蛋白穩(wěn)定表達細胞系。采用RT-PCR擴增PEDV新流行毒株CH-HuN1301株N基因,分別克隆至原核表達載體pET28a和真核表達載體pEGFP-C1構(gòu)建重組表達載體,所測定的序列采用Mega 5.0軟件進行進化分析。將原核表達的N蛋白免疫家兔制備多克隆抗體,重組真核表達載體pEGFP-PEDV-N轉(zhuǎn)染HEK293細胞,經(jīng)用G418篩選獲得穩(wěn)定的表達細胞系。熒光倒置顯微鏡觀察細胞熒光,免疫過氧化物酶單層細胞染色法(IPMA)檢測N蛋白的表達。結(jié)果表明,PEDV HuN1301-14毒株N基因大小為1 323bp,原核表達重組N蛋白分子質(zhì)量約60ku,其多克隆抗體與PEDV呈特異性反應(yīng),熒光倒置顯微鏡觀察和IPMA檢測結(jié)果顯示N蛋白在HEK293細胞中穩(wěn)定表達。該細胞系的建立為進一步研究PEDV的診斷方法提供了基礎(chǔ)材料。
[Abstract]:The aim of this study was to establish a stable expression cell line of N protein of porcine epidemic diarrhea virus (porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) CH-HuN1301 strain. The N gene of CH-HuN1301 strain was amplified by RT-PCR and cloned into prokaryotic expression vector pET28a and eukaryotic expression vector pEGFP-C1 respectively. The sequence was analyzed by Mega 5.0 software. The polyclonal antibody was prepared by immunizing rabbits with prokaryotic expressed N protein. The recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-PEDV-N was transfected into HEK293 cells and a stable expression cell line was obtained by G418 screening. Fluorescence inversion microscope was used to observe the fluorescence and immunoperoxidase monolayer (IPMA) was used to detect the expression of N protein. The results showed that the size of N gene of PEDV HuN1301-14 strain was 1 323 BP, and the molecular weight of recombinant N protein expressed in prokaryotic was about 60 ku.Its polyclonal antibody reacted specifically with PEDV. Fluorescence inverted microscope and IPMA analysis showed that N protein was stably expressed in HEK293 cells. The establishment of the cell line provides basic materials for further study on the diagnostic method of PEDV.
【作者單位】： 衡陽師范學院生命科學與環(huán)境學院;衡陽師范學院生物藥物研究所;衡陽師范學院湖南益豚生態(tài)農(nóng)業(yè)有限責任公司聯(lián)合研究中心;
【基金】：國家自然科學基金青年基金(31101837) 衡陽師范學院引進人才專項項目(16D20) 湖南省教育廳優(yōu)秀青年項目(17B038)
【分類號】：S852.651

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本文編號：2373633