發(fā)布時(shí)間：2018-11-03 18:59

【摘要】：低溫酯酶在低溫下具有高催化活性,使其在食品、洗滌和環(huán)境保護(hù)等工業(yè)領(lǐng)域有著更大的應(yīng)用潛力。酯酶能酶解奶油產(chǎn)生奶酪特有香氣的中、短碳鏈脂肪酸,可用于奶制品香精基料的開發(fā)。冰川環(huán)境是較少受到人類活動(dòng)影響的開放性系統(tǒng),蘊(yùn)藏著豐富的低溫微生物及酶資源,近年來(lái)由于全球氣候變暖,冰川持續(xù)消融和退縮,使得開發(fā)其資源刻不容緩,目前成為極端微生物研究的熱點(diǎn)之一。本論文依托新疆天山1號(hào)冰川資源,篩選能水解奶油產(chǎn)生中、短碳鏈脂肪酸的低溫酯酶產(chǎn)生菌,通過常溫常壓等離子體(ARTP)誘變、基因工程等技術(shù)手段提高酶的產(chǎn)量,并進(jìn)一步探討酯酶酶解稀奶油的工藝及參數(shù),同時(shí)利用現(xiàn)代食品風(fēng)味分析手段對(duì)比分析并鑒定奶制品原料、低溫酯酶酶解產(chǎn)物、自制奶味香精及市售牛奶香精的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),為開發(fā)新型低溫酯酶酶制劑提供重要的理論依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:(1)從采自天山1號(hào)冰川沉積層的土樣和冰川融水樣中,分離出377株可培養(yǎng)細(xì)菌,通過重復(fù)序列PCR(rep-PCR)技術(shù)鑒定后,最終選取了61株菌落形態(tài)特征差異較大的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、細(xì)胞和形態(tài)特性的研究,并通過3種選擇培養(yǎng)基進(jìn)行初篩,其中有10株菌在三丁酸甘油酯平板上出現(xiàn)較大透明圈,再通過酯酶活性測(cè)定確定出5株產(chǎn)酯酶能力較強(qiáng)的細(xì)菌,其中T1-39分解對(duì)硝基苯酚丁酸酯(pNPB)活力最強(qiáng)為8.96U/mL。同時(shí)對(duì)這5株產(chǎn)酯酶菌株的菌落形態(tài)、生理生化特征及分子生物學(xué)特性進(jìn)行了分析鑒定,其中,菌株T1-39被鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonas sp.),命名為Pseudomonas sp.T1-39,其16S r RNA基因序列的GenBank登錄號(hào)為KP780205。(2)研究了ARTP快速誘變菌株P(guān)seudomonas sp.T1-39,并結(jié)合三丁酸甘油酯平板及pNPB酶活測(cè)定法進(jìn)行篩選,獲得TB1、TB11、D3三株酶活較高的正突變菌株,通過遺傳穩(wěn)定性及生長(zhǎng)規(guī)律的研究,確定了1株遺傳穩(wěn)定性好、增殖速率快的菌株TB11進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶,其酶活力比原始菌株提高了3.45倍。通過培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件的確定,得出突變株P(guān)seudomonas sp.TB11產(chǎn)酯酶工藝為:以稀奶油為誘導(dǎo)劑,胰蛋白胨和硫酸銨為氮源,添加2%的PVA,初始pH 9.0,發(fā)酵溫度15℃,2%的接種量,裝液量20 mL/250mL,200 rpm的搖床轉(zhuǎn)速下,發(fā)酵32 h,得到的酯酶命名為Est TB11,酶活力為58.92U/mL,是優(yōu)化前的1.48倍,是原始菌株P(guān)seudomonas sp.T1-39酯酶的6.58倍。(3)采用硫酸銨沉淀、Q Sepharose FF離子層析和Superdex G75凝膠過濾層析對(duì)酯酶Est TB11進(jìn)行了分離純化,并在此基礎(chǔ)上,對(duì)酯酶蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、肽指紋圖譜及N-端氨基酸序列進(jìn)行了分析鑒定,采用基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(5800MALDI-TOF/TOF)確定酯酶蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為64.601 kDa,N-端的10個(gè)氨基酸序列為GVYDYKNLTT。進(jìn)一步探討了純化后酯酶的酶學(xué)性質(zhì),得出最適酶反應(yīng)pH為8.5,且在pH7.0~10.0的范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性,最適溫度為25℃,因此,在低溫條件下占有較好的優(yōu)勢(shì)。而且,EstTB11在15℃~35℃范圍內(nèi)較穩(wěn)定,保溫720 min時(shí),在15℃~25℃下持有約90%的殘余酶活,在35℃下約有80%的殘余酶活。45℃保溫60 min仍可保持約65%的相對(duì)酶活,表現(xiàn)出較高的熱穩(wěn)定性。同時(shí)研究表明,酯酶EstTB11在以p-NPB和p-NPC(C4~C5)為底物時(shí)表現(xiàn)較高的酶活,可見該酯酶對(duì)中、短碳鏈酯具有較好的催化作用,這也進(jìn)一步闡釋了該酯酶在食品工業(yè)及奶制品增香方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。(4)研究了低溫酯酶Est TB11基因的克隆表達(dá)、重組蛋白的純化及性質(zhì)。通過染色體步移技術(shù)并結(jié)合Est TB11酯酶的氮端氨基酸序列,從Pseudomonas sp.TB11基因組擴(kuò)增得到一段長(zhǎng)為1848 bp的開放閱讀框,編碼615個(gè)氨基酸,并預(yù)測(cè)了酯酶的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu);再通過構(gòu)建重組表達(dá)載體,在大腸桿菌Rosetta(DE3)中獲得表達(dá),測(cè)得酶活力為10.67 U/mL,是原始菌株酶活的1.19倍,但與突變株酶活相比偏低,大部分表達(dá)蛋白以包涵體形式存在。表達(dá)后的蛋白通過鎳離子親和層析、透析獲得的重組蛋白restT復(fù)性成功,且該蛋白對(duì)中、短碳鏈的酯水解能力較強(qiáng),其水解pNPB的比活力為195.03U/mg;進(jìn)一步研究了重組酯酶的酶學(xué)特性,結(jié)果表明rest T最適作用溫度為20℃左右,最適pH為8.5,在終濃度為5 mmol/L的K+、Ba2+和Na+存在下對(duì)其有激活作用。(5)采用SPME-GC/MS和電子鼻檢測(cè)技術(shù)分析了稀奶油、酯酶restT酶解物、諾維信Palatase 20000L酶解物及兩種商品牛奶香精的揮發(fā)性化合物,并對(duì)香氣相似性進(jìn)行了比較。通過兩種酶酶解工藝及酶解產(chǎn)物GC/MS圖譜的對(duì)比分析,表明低溫酯酶rest T在較低溫度下,甚至是4℃時(shí)具有較好的水解能力,能最大程度的保留酶解產(chǎn)物香氣組分,使獲得的奶香更加逼真;并采用電子鼻檢測(cè)技術(shù)對(duì)8種不同樣品進(jìn)行處理,通過雷達(dá)指紋圖譜分析、PCA主成分分析及DFA數(shù)據(jù)分析,結(jié)果均表明,與酶解產(chǎn)物、商品牛奶香精相比,自制天然奶味香精與稀奶油、純牛奶原料的相似度更高,更接近于天然奶香味且區(qū)別于合成牛奶香精,為開發(fā)新型低溫酯酶酶制劑提供了重要的理論依據(jù)。同時(shí),也進(jìn)一步表明電子鼻技術(shù)可以輔助SPME-GC/MS分析技術(shù),能夠迅速評(píng)價(jià)樣品的香氣品質(zhì)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TS264.3

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 歐光南;三丁酸甘油酯乙酯化和皂化競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究[J];集美大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1999年04期

2 ;[J];;年期

相關(guān)會(huì)議論文 前8條

1 張俊;侯永清;朱惠玲;李嬌龍;邱洪儀;丁斌鷹;;日糧中添加三丁酸甘油酯對(duì)急性應(yīng)激肉仔雞腸黏膜能量狀態(tài)的影響[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)分會(huì)第十一次全國(guó)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

2 殷紅;陳子興;岑建農(nóng);王瑋;傅建新;姚利;;三丁酸甘油酯誘導(dǎo)白血病細(xì)胞增殖抑制、分化、凋亡及其機(jī)理的研究[A];第九屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2003年

3 張俊;侯永清;朱惠玲;李嬌龍;邱洪儀;丁斌鷹;;日糧中添加三丁酸甘油酯對(duì)急性應(yīng)激肉仔雞腸道二糖酶活性的影響[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)分會(huì)第十一次全國(guó)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

4 陳星;王清靜;侯永清;丁斌鷹;王蕾;朱惠玲;;三丁酸甘油酯對(duì)乙酸誘導(dǎo)結(jié)腸炎仔豬的生長(zhǎng)性能和小腸形態(tài)的影響[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)分會(huì)第十一次全國(guó)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

5 嚴(yán)志強(qiáng);張明亮;沈?qū)殬s;姜宗來(lái);;三丁酸甘油酯調(diào)控低血流誘導(dǎo)頸總動(dòng)脈血管重建機(jī)制[A];第七屆海峽兩岸心血管科學(xué)研討會(huì)論文集[C];2009年

6 陳星;王清靜;侯永清;丁斌鷹;王蕾;朱惠玲;;三丁酸甘油酯對(duì)乙酸誘導(dǎo)結(jié)腸炎仔豬的血液生化指標(biāo)和抗氧化能力的影響[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)分會(huì)第十一次全國(guó)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

7 姜雯;牛曉宇;袁福龍;朱宇君;付宏剛;;KF/La_2O_3固體堿催化劑催化三丁酸甘油酯與甲醇酯交換的活性與穩(wěn)定性研究[A];第十四屆全國(guó)青年催化學(xué)術(shù)會(huì)議會(huì)議論文集[C];2013年

8 嚴(yán)志強(qiáng);張明亮;郭子義;沈?qū)殬s;姜宗來(lái);;組蛋白去乙�；冈诘脱髡T導(dǎo)血管重建中的作用與機(jī)制[A];中國(guó)力學(xué)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)大會(huì)'2009論文摘要集[C];2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 董娟;冰川低溫酯酶產(chǎn)生菌的選育、基因克隆表達(dá)及在奶味香基制備中的應(yīng)用[D];江南大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 周建;三丁酸甘油酯在肉雞飼料中的應(yīng)用效果研究[D];武漢輕工大學(xué);2015年

2 王萌;三丁酸甘油酯和牛至油在斷奶仔豬飼糧中應(yīng)用效果的研究[D];沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

3 邱洪儀;三丁酸甘油酯和包被丁酸鈉對(duì)慢性應(yīng)激肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、二糖酶活性及脂質(zhì)代謝的影響[D];武漢輕工大學(xué);2013年

4 李嬌龍;三丁酸甘油酯對(duì)LPS多次刺激肉雞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的影響[D];武漢輕工大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：2308677