【摘要】：研究背景我國是全世界肝癌的高發(fā)地區(qū)之一,其占我國惡性腫瘤死亡原因的第三位。早期肝癌往往不易發(fā)現(xiàn),一旦發(fā)現(xiàn)多數(shù)已屬中晚期,即使手術切除,大部分患者仍會在術后5年內(nèi)發(fā)生轉移和復發(fā)�？偟膩碚f,肝癌的發(fā)生發(fā)展與基因組不穩(wěn)定和突變有密切關系,基因表達失控和蛋白調(diào)節(jié)紊亂現(xiàn)象的積累最終導致了肝癌的發(fā)生與發(fā)展。近年來,雖然在肝癌的臨床研究方面取得了很多進展,如多蛋白激酶抑制劑—索拉菲尼用于肝癌的治療。但是肝癌早期診斷難,晚期治療效果差的現(xiàn)狀仍然沒有被改變。因此,深入理解肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制,尋找新的治療及藥物靶點迫在眉睫。人類SUSD2基因位于22q11-q12,編碼蛋白含有822個氨基酸,為一類位于細胞質膜的Ⅰ型膜蛋白,其蛋白質結構包括4部分：促細胞生成素B結構域(Somatomedin B domain,SMB); AMOP; von Willebrand factor,type D結構域(vWD); Sushi/SCR/CCP結構域。其中AMOP是一個胞外結構域,有研究表明,該結構域與細胞粘附有密切關聯(lián)。von Willebrand factor (vWF)屬于生長調(diào)節(jié)因子,該結構存在于多種血漿蛋白中,細胞內(nèi)主要功能包括轉錄、DNA修復、膜運輸和蛋白酶體作用。含有v WF結構的多蛋白復合體的功能包括細胞粘附、遷移、信號傳導等。近年來,SUSD2基因在腫瘤中的作用得到了一些學者的關注,口前的研究表明SUSD2在非小細胞肺癌、乳腺癌、腎透明細胞癌以及結直腸癌中都存在異常表達,然而對于SUSD2基因在肝癌中的表達及生物學功能還未見報道。因此,本課題以肝癌為對象,首先在臨床標本中進行SUSD2基因表達水平的檢測,再通過脂質體轉染技術上調(diào)和下調(diào)該基因在細胞中的表達水平進行生物學功能研究,以期發(fā)現(xiàn)新的肝癌生物指標和治療靶點。研究方法1、采用GEO數(shù)據(jù)庫中肝細胞癌相關的兩個組織標本表達譜基因芯片數(shù)據(jù)GSE17856、GSE45114,利用生物信息學軟件Qlucore Omics Explorer (QOE)分別分析并篩選出在肝細胞癌組織與癌旁正常肝組織中表達有差異的基因,合并兩組數(shù)據(jù),篩選出共同上下調(diào)表達的差異基因。利用DAVID在線分析這些共同表達差異的基因的通路及功能,結合文獻發(fā)現(xiàn)新的肝癌相關基因。2、采用熒光定量PCR和Western Blot檢測8例接受肝癌切除手術的患者標本以及對應癌旁正常肝組織中SUSD2 mRNA和蛋白質表達水平。3、通過免疫組化聯(lián)合組織芯片的方法,分析SUSD2在180例肝癌組織及16例正常肝組織中的表達水平以及SUSD2蛋白的細胞定位。采用ROC曲線確定SUSD2高表達的最佳取舍點(cut-off值)并初步分析SUSD2表達水平與肝癌患者的臨床病理學特征之間的關系。4、利用脂質體轉染技術,將pcDNA3.1-SUSD2質粒載體和psi-mH1-SUSD2質粒載體轉入HepG2和SMMC7721細胞中,利用Western Blot進行重組細胞SUSD2蛋白表達水平的鑒定。5、采用CCK-8法檢測上調(diào)和下調(diào)SUSD2表達水平后對HepG2和SMMC7721細胞增殖能力的影響。6、流式細胞術檢測SUSD2表達水平的變化對細胞凋亡的影響。7、劃痕愈合實驗檢測SUSD2表達水平的改變對HepG2和SMMC7721細胞遷移能力的影響。8、Transwell實驗檢測SUSD2表達水平的改變對細胞侵襲能力的影響。研究結果1、肝細胞癌相關基因的篩選及生物信息學分析：利用QOE軟件篩選出共同差異表達基因353個,其中共同上調(diào)基因171個,下調(diào)表達基因182個。運用DAVID在線分析軟件對這些差異基因進行功能注釋和通路分析,發(fā)現(xiàn)這些基因的主要功能與細胞凋亡、細胞粘附、氧化還原等有關,還與p53信號通路、Jak-STAT信號通路等相關。對差異基因進行文獻挖掘,首次發(fā)現(xiàn)SUSD2基因可能與肝細胞癌有關。2、SUSD2基因在8例新鮮臨床樣本中的表達水平分析：利用q-PCR和Western Blot檢測8例接受肝葉切除手術的患者標本以及對應癌旁正常肝組織中SUSD2的表達情況,q-PCR結果顯示：8例臨床樣本中,7例肝癌組織的SUSD2 mRNA表達水平顯著低于對應的癌旁正常組織(P0.05)。Western Blot結果顯示8例臨床樣本中,7例肝癌組織中SUSD2蛋白表達水平顯著低于癌旁正常肝組織,與q-PCR結果一致。3、利用免疫組化檢測SUSD2在180例肝癌及16例正常肝組織中的表達水平以及細胞定位。結果顯示：SUSD2蛋白主要分布在包漿和包膜。根據(jù)臨床病理資料(性別、年齡、pT、pN、pM、臨床分期、組織學分級)繪制出的ROC曲線,結果提示陽性表達的腫瘤細胞在所有腫瘤細胞數(shù)中所占比例超過52.5%為高表達。基于此最佳臨界值,在大部分腫瘤組織樣品中SUSD2呈現(xiàn)低表達(112/180),而在正常肝組織樣品中呈現(xiàn)高表達(16/16),兩者具有統(tǒng)計學差異(P=0.000)。進一步分析SUSD2表達量與臨床病理特征間的關系,結果表明：SUSD2的表達量與pT分期(χ2= 33.175, P= 0.000), pN分期(χ2= 4.785, P= 0.029)、pM分期(χ2=4.620,P=0.032)、病理分級(χ2=5.198,P=0.023)、臨床分期(χ2=30.244,P=0.000)有關,而與性別(χ2=0.31,P=0.861)和年齡(χ2=1.093,P=0.296)無顯著相關性。4、經(jīng)Western Blot檢測,瞬時轉染了重組質粒pcDNA3.1-SUSD2的HepG2細胞中SUSD2表達水平顯著高于對照組,轉染psi-mH1-SUSD2的SMMC7721細胞中SUSD2的表達水平顯著低于對照組。5、CCK-8檢測細胞增殖能力,實驗結果顯示：提高SUSD2的表達水后,能夠對HepG2細胞增殖產(chǎn)生顯著的抑制作用(P0.05)；降低SUSD2的表達水平后能夠對SMMC7721細胞的增殖產(chǎn)生顯著的促進作用(P0.05)。6、流式細胞術檢測SUSD2表達量的改變對細胞凋亡的影響,實驗結果表明,上調(diào)SUSD2的表達水平后HepG2細胞的凋亡數(shù)量與對照組相比顯著增加(P0.05),下調(diào)SUSD2的表達水平SMMC7721細胞的凋亡數(shù)量較對照組顯著減少(P0.05)。7、劃痕愈合實驗結果表明,在過表達組,HepG2細胞遷移的相對距離較對照組顯著降低(P0.05),在干擾組,SMMC7721細胞遷移的相對距離較對照組顯著增加(P0.05)。8、Transwell基質膠小室法檢測細胞侵襲能力,結果顯示：在過表達組,HepG2細胞穿膜數(shù)較對照組顯著減少(P0.05),在干擾組,SMMC7721細胞穿膜數(shù)較對照組顯著增多(P0.05)。結論通過對兩組基因芯片表達譜數(shù)據(jù)的生物信息學分析及文獻挖掘,發(fā)現(xiàn)新的肝癌相關基因SUSD2。收集臨床標本,分析SUSD2基因在臨床標本中的表達量,發(fā)現(xiàn)SUSD2(?)表達于肝癌組織而相對高表達于正常肝組織。進一步分析發(fā)現(xiàn)SUSD2的表達水平與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關,SUSD2表達量越低,癌組織分化程度越低,臨床分期越高。在生物功能方面,分別建立了轉染過表達載體和干擾載體的HepG2細胞株和SMMC7721細胞株；證明了上調(diào)SUSD2的表達量能顯著抑制細胞的增殖能力,抑制細胞的遷移和侵襲能力、促進細胞的凋亡；下調(diào)SUSD2的表達量能顯著促進細胞的增殖、促進細胞侵襲和遷移能力,抑制細胞的凋亡。綜合以上實驗,SUSD2參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展,且可能作為抑癌基因發(fā)揮作用,為進一步理解肝癌的分子機制提供了新的視角,也為肝癌的診斷及治療提供了新的研究靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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