【摘要】：為了探究微藻硬脂酰載體蛋白去飽和酶(SAD)基因在蛋白核小球藻不飽和脂肪酸合成調(diào)控中的作用,提高藻細(xì)胞中不飽和脂肪酸的含量,本文采用基因槍法將若夫小球藻的SAD基因?qū)氲降鞍缀诵∏蛟宓娜~綠體中,利用鏈霉素抗性篩選,經(jīng)同質(zhì)化培養(yǎng),成功獲得了轉(zhuǎn)化藻。以野生蛋白核小球藻為對(duì)照,對(duì)轉(zhuǎn)化藻進(jìn)行了PCR驗(yàn)證和熒光定量分析,并且對(duì)脂肪酸組成和SAD基因在蛋白核小球藻不飽和脂肪酸合成過(guò)程中的調(diào)控作用進(jìn)行了分析。本文系首次用基因槍法對(duì)蛋白核小球藻成功進(jìn)行了葉綠體轉(zhuǎn)化,并探究了SAD基因?qū)ξ⒃宀伙柡椭舅岷铣傻挠绊?加深了對(duì)微藻油脂合成調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)。本文的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:(1)確定了蛋白核小球藻基因工程篩選標(biāo)記及對(duì)同源片段chlL基因進(jìn)行了驗(yàn)證。通過(guò)研究蛋白核小球藻對(duì)6種抗生素的敏感性,結(jié)果表明鏈霉素濃度為200μg/mL時(shí)能在8天左右觀察到蛋白核小球藻細(xì)胞全部死亡,確定aadA基因可作為蛋白核小球藻基因工程篩選標(biāo)記;通過(guò)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證了chlL基因作為蛋白核小球藻葉綠體轉(zhuǎn)化中同源片段的可行性。(2)成功構(gòu)建了以chlL基因序列為同源片段、分別以萊茵衣藻葉綠體中的atpA和rbcL作為SAD基因的啟動(dòng)子和終止子、aadA基因作為篩選標(biāo)記的葉綠體表達(dá)載體。(3)利用基因槍法將攜帶有SAD基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到蛋白核小球藻的葉綠體中,利用鏈霉素抗性對(duì)轉(zhuǎn)化后的蛋白核小球藻進(jìn)行了篩選,在抗性壓力下完成了同質(zhì)化培養(yǎng)。(4)對(duì)轉(zhuǎn)化藻的外源基因進(jìn)行了普通PCR檢測(cè),對(duì)aadA基因進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)及對(duì)SAD基因熒光定量PCR檢測(cè),結(jié)果表明aadA基因、SAD基因均成功整合到蛋白核小球藻的葉綠體基因組中并成功轉(zhuǎn)錄,而且SAD基因?qū)崿F(xiàn)了過(guò)量表達(dá)。(5)藻的油脂脂肪酸組成分析結(jié)果顯示,C17:1大幅上升,提示若夫小球藻SAD基因編碼的酶可能具有對(duì)脂肪酸C17:0去飽和的能力;結(jié)果還顯示總不飽和脂肪酸含量有所增加,提示外源SAD基因表達(dá)促進(jìn)了不飽和脂肪酸合成。
[Abstract]:In order to investigate the role of (SAD) gene in the synthesis and regulation of unsaturated fatty acids in Chlorella vulgaris, the content of unsaturated fatty acids in algae cells was increased. In this paper, the SAD gene of Chlorella luteus was introduced into chloroplast of Chlorella Proteus by gene gun method. The transformed algae was successfully obtained by streptomycin resistance screening and homogenization culture. The PCR verification and fluorescence quantitative analysis of transforming Chlorella sp. Were carried out with the wild protein Chlorella nucleocephala as control, and the fatty acid composition and the regulation of SAD gene in the synthesis of unsaturated fatty acids of Chlorella protein were analyzed. In this paper, the chloroplast transformation of Chlorella Proteinuclear Chlorella was successfully carried out by means of gene gun method, and the effect of SAD gene on the synthesis of unsaturated fatty acids in microalgae was studied, which deepened the understanding of the regulation mechanism of microalgae oil synthesis. The main contents and results are as follows: (1) the screening markers of Chlorella protein nuclear Chlorella were identified and the homologous chlL gene was verified. The sensitivity of Chlorella Proteinuclear Chlorella to 6 antibiotics was studied. The results showed that when the concentration of streptomycin was 200 渭 g/mL, all the cells could be observed to die at about 8 days. It was confirmed that aadA gene could be used as a screening marker for gene engineering of Chlorella putamen, and the feasibility of using chlL gene as a homologous fragment in chloroplast transformation of Chlorella putamen was verified by PCR amplification. (2) the sequence of chlL gene was successfully constructed as homologous fragment. AtpA and rbcL in chloroplast of Chlamydomonas rhinella were used as promoter and Terminator of SAD gene respectively. AadA gene was used as the chloroplast expression vector of screening marker. (3) Recombinant plasmid carrying SAD gene was introduced into protein nucleus by gene gun method. In the chloroplasts of Chlorella vulgaris, Streptomycin resistance was used to screen the transformed Chlorella Proteinuclear Chlorella, and homogenized culture was completed under the pressure of resistance. (4) Common PCR was used to detect the exogenous genes of the transformed algae. AadA gene was detected by RT-PCR and SAD gene was detected by fluorescence quantitative PCR. The results showed that aadA gene and SAD gene were successfully integrated into chloroplast genome of Chlorella putamen and transcribed successfully. Moreover, the SAD gene was overexpressed. (5) the fatty acid composition analysis of the oil and fat of the algae showed that C17: 1 increased significantly, suggesting that the enzyme encoded by the SAD gene of Chlorella luteum may have the ability to desaturate the fatty acid C17: 0; The results also showed that the content of total unsaturated fatty acids increased, suggesting that exogenous SAD gene expression promoted the synthesis of unsaturated fatty acids.
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：TS201.2

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