MybA1是調(diào)控合成花色苷重要酶UFGT的重要因子。本文以釀酒葡萄赤霞珠為試材。首先采用PCR技術(shù)獲得MybA1基因全長序列,構(gòu)建克隆載體和表達載體獲得重組質(zhì)粒pET-mybA1, IPTG誘導(dǎo)表達后經(jīng)Ni-NTA親和純化得到高純度重組蛋白,并以此為抗原免疫新西蘭大白兔,獲得了高效價、高特異性的MYBA1多克隆抗體。其次,采用western blot分析MYBA1蛋白在赤霞珠果實花后各時期以及各組織部位的表達規(guī)律,熒光定量技術(shù)分析VvmybA1基因在赤霞珠果實花后各時期以及各組織部位的瞬時表達規(guī)律,并將MybA1與LAR1、LAR2、DFR、ANS、ANR和UFGT的表達以及各基因與花色苷積累進行了相關(guān)性分析,得到的結(jié)果如下：(1)克隆獲得了751bp、具有完整編碼框的MybA1基因片段,其編碼的一個由250個氨基酸組成、分子量約為28kDa的多肽。成功構(gòu)建了重組表達載體pET-mybA1。(2)通過對MybA1的基因進行生物學(xué)分析得出：MYBA1蛋白為親水性,定位于膜外,屬于SANT超基因家族；二級結(jié)構(gòu)由α螺旋、無規(guī)則卷曲、少部分延伸鏈以及很少的β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)構(gòu)成;三級結(jié)構(gòu)顯示該蛋白為典型的R2R3-MYB蛋白；在所有含MybAl基因的幾種物種中只有變?nèi)~葡萄與葡萄的同源性較高,其它非葡萄科物種與葡萄的同源性均較低。(3) IPTG農(nóng)度為0.6mmol/L、37℃條件下誘導(dǎo)5h的條件下獲得高表達的重組蛋白,經(jīng)Ni-NTA親和純化獲得高純度的MYBA1融合表達蛋白。以His-mybA1為抗原成功獲得具有高效價(1：512,000)和良好特異性的MYBA1葡萄多克隆抗體。(4)葡萄果實花色苷含量的變化趨勢為先增加后呈平緩趨勢,即在花后轉(zhuǎn)色期之前幾乎沒有積累,在花后轉(zhuǎn)色期開始含量劇增且于花后80天達到最高值,之后趨于穩(wěn)定。(5)通過對MybAl進行基因表達分析得出：在葡萄各組織中,MybAl在果實中大量表達。果實的花后各時期MybAl的表達規(guī)律為在轉(zhuǎn)色前期幾乎不表達,進入轉(zhuǎn)色期后表達量劇增,并在轉(zhuǎn)色成熟期即花后80天達到最大值;對MYBA1進行Western-blot分析得出：在葡萄各組織中,MYBA1在葉片中的表達量最高,果實中的表達量最小,卷須、根、莖和芽的表達量介于兩者之間且相差不大。果實的花后各時期MYBA1的表達規(guī)律為在轉(zhuǎn)色前期幾乎不表達,進入轉(zhuǎn)色期后表達量劇增,并在轉(zhuǎn)色成熟期即花后70天達到最大值。(6)相關(guān)性分析結(jié)果顯示：MybA1mRNA含量與MYBA1蛋白的表達呈正相關(guān)。MYBA1蛋白的表達量與ANSmRNA、DFRmRNA的含量呈正相關(guān),與UFGTmRNA的含量呈顯著正相關(guān);MybA1mRNA含量與DFRmRNA、UFGTmRNA的含量呈顯著正相關(guān),與ANSmRNA的含量呈極顯著正相關(guān)�；ㄉ蘸康姆e累與MYBA1蛋白表達呈正相關(guān);與ANSmRNA的含量呈正相關(guān),其中與MybA1mRNA、UFGTmRNA、DFRmRNA的含量呈顯著正相關(guān)。


本文編號：2273018