【摘要】：人與小鼠腦組織轉(zhuǎn)錄組基因表達與功能比較研究背景：伴隨人口老齡化趨勢日益加劇,神經(jīng)退行性疾病已成為影響人類生命健康及生活質(zhì)量的主要疾病負擔。截止目前,這類疾病的病因及發(fā)病機制仍不清楚,在臨床上也尚無控制病程進展的有效措施。建立理想的動物模型對于探索這類疾病的發(fā)病機制及藥物篩選十分重要。小鼠因為其體積小,妊娠期短,飼養(yǎng)成本低,基因工程技術(shù)相對成熟,大腦解剖結(jié)構(gòu)和生理功能與人類較為接近而成為用于模擬人類神經(jīng)退行性疾病較為理想的模式動物。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠的首要問題是要考慮某個感興趣基因的表達及功能在健康人與小鼠之間是否一致。因此,弄清健康人與小鼠大腦轉(zhuǎn)錄組基因表達與功能的相似性及差異性,不僅能為建立神經(jīng)退行性疾病小鼠模型并評價其有效性和準確性提供參考,也有助于從轉(zhuǎn)錄組水平上解釋人與小鼠學習記憶與認知能力差異的潛在原因。方法：健康成年人與小鼠前額葉皮層(prefrontal cortex, PFC)、海馬(hippocampus,HIP)及紋狀體(striatum, STR)的基因(mRNA)表達譜數(shù)據(jù)來源于GEO數(shù)據(jù)庫。利用Expression Console軟件預(yù)處理原始數(shù)據(jù),RMA算法標準化探針。利用百分位數(shù)法挖掘相對高表達基因并通過DAVID軟件進行功能富集分析。Venn分析用于描述不同生物學過程(Biological process, BP)節(jié)點集的重疊率；R包GOSemSim的mgoSim函數(shù)用于GO語義相似性分析。對同源基因的熒光信號校正后利用1-皮爾森相關(guān)系數(shù)計算表達距離,分層聚類和主成分分析用于表達模式評估。物種特異表達的同源基因通過比較極端數(shù)據(jù)集的方法挖掘并利用實驗驗證。Limma算法及百分位倍數(shù)變化用于分析差異表達的同源基因,String數(shù)據(jù)庫用于挖掘差異表達同源基因之間的互作關(guān)系,Cytoscape軟件對網(wǎng)絡(luò)可視化。分析網(wǎng)絡(luò)拓撲屬性并利用MCODE算法挖掘高連通的功能子網(wǎng)絡(luò)模塊,DAVID軟件用于分析網(wǎng)絡(luò)功能。利用小RNA測序技術(shù)檢測健康成年人與小鼠海馬組織miRN A的表達。原始數(shù)據(jù)預(yù)處理后,鑒定已知成熟的miRNA、其它小RNA及新發(fā)現(xiàn)的miRNA。新miRNA的靶基因通過TargetScan算法預(yù)測,DAVID軟件用于靶基因功能注釋。成熟miRNA的表達水平通過TPM(transcripts per million)標準化,利用DIANA-mirPath v3.0軟件分析人與小鼠海馬富集或特異表達的miRNA功能。Spearman相關(guān)系數(shù)用于分析兩物種海馬miRNA的表達模式。相對小鼠,人海馬顯著差異表達的miRNA通過edgeR算法和倍數(shù)變化鑒定。miRanda、Pictar、DIANA-microT以及Targetscan算法用來預(yù)測差異miRNA的靶基因,根據(jù)反向調(diào)節(jié)的原則進一步篩選miRNA-mRNA互作關(guān)系對。利用Cytoscape軟件可視化相對小鼠的人海馬差異miRNA-mRNA功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果：人與小鼠對應(yīng)腦組織高表達基因顯著富集的主要BP節(jié)點高度一致；顯著富集的KEGG通路及其顯著性相似；PFC、HIP及STR中同源基因的表達模式在人與小鼠間高度保守。人腦組織高表達基因顯著富集的BP節(jié)點約為小鼠對應(yīng)腦組織的兩倍：與神經(jīng)活動相關(guān)的BP節(jié)點也顯著多于小鼠,其中神經(jīng)元投射的生成與發(fā)育為人類特有；腦組織高表達基因功能富集結(jié)果中相同BP節(jié)點的顯著性具有物種特異性；兩物種對應(yīng)腦組織高表達基因顯著富集的BP節(jié)點重疊率及語義相似性具有明顯的物種特異性；COX5B, WIF1, SLC4A10和PLA2G7為鑒定的物種特異表達的同源基因；相對小鼠腦組織,人對應(yīng)腦組織差異表達的同源基因功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有無尺度和小世界屬性,存在與神經(jīng)活動顯著相關(guān)的子網(wǎng)絡(luò)功能模塊。在人海馬組織中新鑒定出一條miRNA, Novel-21-5p,其候選靶基因主要在突觸,突觸小體,囊泡,突觸后密集區(qū),投射神經(jīng)元上表達,參與了神經(jīng)遞質(zhì)傳遞,神經(jīng)營養(yǎng)信號通路及膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展等。miR-9-5p在人與小鼠海馬中表達量占比最高。人海馬富集表達的前20個miRNA參與了神經(jīng)營養(yǎng)因子TRK受體信號通路,突觸傳遞及軸突導向等生物學過程。人海馬特異表達的,miR-656-3p參與了突觸傳遞,神經(jīng)營養(yǎng)因子TRK受體信號通路,神經(jīng)元細胞-細胞粘連等生物學過程。人與小鼠海馬同源miRNA的表達模式高度保守,表達保守性與序列保守性呈正相關(guān)。相對小鼠海馬的人海馬差異miRNA-mRNA功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為二分圖,其中下調(diào)網(wǎng)絡(luò)與模式規(guī)范過程,區(qū)域化,前-后模式形成,視覺感知,光刺激的感官知覺等生物學過程相關(guān)。結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)人與小鼠對應(yīng)腦組織高表達基因的主要功能相似,人與小鼠海馬富集表達的miRNA種類相似；同源mRNA及miRNA表達模式高度保守,這可能是人與小鼠大腦解剖結(jié)構(gòu)及細胞類型保持高度一致的遺傳基礎(chǔ),說明在一定程度上小鼠可以準確有效地用于模擬人類神經(jīng)系統(tǒng)的生理病理過程。然而人腦組織高表達基因功能相對小鼠更加復(fù)雜多樣；人與小鼠腦組織高表達基因的生物功能趨于物種相似性；兩物種間存在差異調(diào)控的子網(wǎng)絡(luò)模塊,并與神經(jīng)生理病理過程相關(guān)；人海馬中新鑒定的、特異表達的、富集表達的rniRNA以及下調(diào)miRNA-mRNA功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)均參與了重要的神經(jīng)生理病理過程。這些結(jié)果可為進一步理解人與小鼠神經(jīng)行為表型差異提供分子遺傳基礎(chǔ)。多巴胺D5受體與胃泌素受體相互作用及其促尿鈉排泄效應(yīng)研究背景：腎臟多巴胺D1樣受體(D1R和D5R)及胃泌素受體(CCKBR)在維持機體鈉平衡中扮演著重要角色。先前的研究表明D1R與CCKBR在腎近曲小管(renal proximal tubule, RPT)中協(xié)同互作,具有促尿鈉排泄的作用。相比D1R,D5R具有持續(xù)活性,對多巴胺的親和力更強。因此本研究旨在探索D5R與CCKBR的相互作用及其促尿鈉排泄效應(yīng)。方法:利用免疫印跡技術(shù)檢測CCKBR配體gastrin、CCKBR特異性抑制劑Y F476、 gastrin+YF476處理的人腎小管上皮細胞(human renal tubular epithelial cell line, HK-2)中D5R表達；檢測D1R/D5R特異性激動劑fenoldopam、特異性抑制劑Sch23390、fenoldopam+Sch23390處理的HK-2細胞中CCKBR表達；并檢測gastrin促進D5R表達以及fenoldopam促進CCKBR表達的時間與劑量依賴效應(yīng)。利用異源表達人D5R和CCKBR的HEK293細胞(HEK293-D5R-CCKBR)及血壓正常人的RPT細胞(NT)驗證D5R與CCKBR互作的特異性。利用免疫共沉淀技術(shù)檢測D5R與CCKBR在HK-2及HEK293-D5R-CCKBR細胞中的直接互作效應(yīng)；利用免疫熒光共定位技術(shù)檢測D5R與CCKBR在HK-2細胞及BALB/c、鼠RPT中的亞細胞定位。利用免疫印跡技術(shù)檢測D5R及CCKBR基因敲除(D5R-/-及CCKBR-/-)小鼠腎皮質(zhì)細胞膜CCKBR及D5R蛋白表達。高鹽喂養(yǎng)4月齡雄性BALB/c小鼠2周后分為7組,分別腹腔注射生理鹽水、Sch23390、YF476、 fenoldopam、gastri、fenoldopam+YF476及gastrin+Sch23390,每天1次,7天后收集24小時尿液并檢測鈉和肌酐濃度。結(jié)果：D5R與CCKBR在HK-2、HEK293-D5R-CCKBR及NT細胞中協(xié)同互作,具有時間與劑量依賴效應(yīng)。D5R與CCKBR在HK-2及HEK293-D5R-CCKBR細胞中共沉淀,在HK-2細胞及BALB/c小鼠RPT中共定位。CCKBR在D5R-/-小鼠腎皮質(zhì)細胞膜上的表達顯著高于D5R+/+小鼠；D5R在CCKBR-/-小鼠腎皮質(zhì)細胞膜上的表達顯著高于C CKBR+/+小鼠。高鹽飲食促進了BALB/c小鼠腎皮質(zhì)細胞膜D5R及CCKBR蛋白表達。CCKBR-/-、鼠相比CCKBR+/+小鼠血壓升高,尿鈉排泄減少。CCKBR特異性抑制劑YF476及D1R/D5R特異性抑制劑Sch23390能夠抑制高鹽飲食誘導的尿鈉排泄效應(yīng)；D1R/D5R特異性抑制劑Sch23390能夠顯著減弱CCKBR配體gastrin誘導的促尿鈉排泄效應(yīng)；CCKBR特異性抑制劑YF476能夠顯著減弱D1R/D5R特異性激動劑fenoldopam誘導的促尿鈉排泄效應(yīng)。結(jié)論：D5R與CCKBR在腎臟中協(xié)同互作,在維持高鹽飲食后機體鈉平衡過程中具有重要作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R741
，

本文編號：2270853