【摘要】：苦蕎(Fagopyrum tataricum)為蓼科蕎麥屬雙子葉禾谷類(lèi)作物。苦蕎作為一種藥食兩用作物,其最重要的生物活性成分為黃酮,以蘆丁為代表的黃酮醇是其主要儲(chǔ)存形式。然而,在遭受冷和紫外等脅迫時(shí),另外一類(lèi)黃酮花青素的合成則對(duì)苦蕎逆境生理的穩(wěn)定具有重要作用。植物花青素的生物合成在轉(zhuǎn)錄水平主要受到R2R3-MYB、bHLH和WD40等轉(zhuǎn)錄因子蛋白單獨(dú)或者形成三元復(fù)合物的調(diào)控,其中轉(zhuǎn)錄因子WD40更多的是提供平臺(tái)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子MYB和bHLH的互作。本研究以“西蕎2號(hào)”苦蕎為材料,克隆花青素調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子FtWD40的cDNA序列,并鑒定其轉(zhuǎn)錄激活活性；分析花青素和FtWD40基因表達(dá)在苦蕎中的組織特異性及其相關(guān)性,也分析了在苦蕎逆境脅迫條件下二者變化趨勢(shì)間的相關(guān)性；進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)鑒定FtWD40過(guò)表達(dá)對(duì)煙草花青素合成的影響。本研究可望明確苦蕎轉(zhuǎn)錄因子FtWD40對(duì)在花青素合成途徑中的主要效應(yīng)基因,加深對(duì)苦蕎逆境脅迫中花青素合成調(diào)控分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。主要取得以下研究結(jié)果：1、采用同源克隆法和RACE技術(shù),獲得1條苦蕎WD40基因,命名為FtWD40。 FtWD40 ORF框?yàn)?035 bp,編碼344個(gè)氨基酸殘基,相對(duì)分子質(zhì)量65.9 KDa;聚類(lèi)分析結(jié)果顯示,FtWD40和參與花青素代謝調(diào)控的AtTTGl和VvWD等聚為一簇。對(duì)花期苦蕎根、莖、葉和花中的花青素含量,以及FtWD40基因表達(dá)的測(cè)定表明,花青素含量和FtWD40的基因表達(dá)量都具有相同的組織特異,均為花根葉莖,二者相關(guān)性系數(shù)為r=0.875(P0.05)。在冷脅迫和UV-B脅迫下,芽期苦蕎花青素含量與FtWD40基因表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)分別為r=0.785(P0.05)和r=0.891(P0.05)。以上結(jié)果表明,FtWD40可能參與了苦蕎花青素合成的調(diào)控。2、構(gòu)建pBridge-FtWD40真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化酵母AH109,經(jīng)SD/-Trp/-His雙缺培養(yǎng)篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。經(jīng)酵母單雜交系統(tǒng)中的β-半乳糖苷酶活性濾紙分析,結(jié)果表明FtWD40蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性。3、構(gòu)建pECMBIA1301-FtWD40植物表達(dá)載體,采用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化煙草愈傷組織,進(jìn)而對(duì)篩選獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草中花青素含量及花青素合成途徑中的NtPAL、NtCHS、NtANS、NtDFR、NtFLS和NtF3'H等基因的表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定分析。FtWD40轉(zhuǎn)基因煙草T-1、T-2和T-3株系中的花青素含量分別提高為對(duì)照平均的3.45倍、2.81倍和3.24倍(P0.01)。同時(shí),qRT-PCR結(jié)果顯示：NtPAL、NtCHS和NtF3'H的表達(dá)量沒(méi)有顯著變化(P0.05),NtDFR和NtANS的表達(dá)量分別提高為對(duì)照組的1.95倍和1.56倍(P0.01),而FLS的表達(dá)量則降低為對(duì)照的0.79倍(P0.05)。以上結(jié)果表明,FtWD40具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草花青素合成的作用。
[Abstract]:Tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum) is a dicotyledonous cereal crop of the genus Polygonaceae. Tartary buckwheat (Tartary buckwheat) is one of the most important bioactive components of Tartary buckwheat as a dual-purpose crop. The flavonol represented by rutin is the main storage form of Tartary buckwheat. However, under cold and UV stress, the synthesis of another flavonoid anthocyanin plays an important role in the stability of buckwheat stress physiology. The biosynthesis of plant anthocyanins is mainly regulated by transcription factor proteins such as R2R3-MYBnbHLH and WD40 alone or forming ternary complexes at the transcriptional level. The transcription factor WD40 provides a platform to facilitate the interaction of transcription factor MYB and bHLH. In this study, the cDNA sequence of anthocyanin regulating transcription factor FtWD40 was cloned and its transcriptional activation activity was identified, and the tissue specificity and correlation of anthocyanin and FtWD40 gene expression in Tartary buckwheat were analyzed. We also analyzed the correlation between the two changes under the stress of Tartary buckwheat, and further identified the effect of FtWD40 overexpression on anthocyanin synthesis by transgenic technology. In this study, we hope to clarify the main effector genes of buckwheat transcription factor FtWD40 in anthocyanin synthesis pathway, and to further understand the molecular mechanism of anthocyanin synthesis regulation in buckwheat stress. The main results are as follows: 1. Using homologous cloning and RACE technique, we obtained a WD40 gene from Tartary Buckwheat, named FtWD40.. The FtWD40 ORF frame was 1035 bp, encoding 344 amino acid residues, and the relative molecular weight of 65.9 KDa; cluster analysis showed that FtWD40 and AtTTGl and VvWD involved in the regulation of anthocyanin metabolism were clustered into a cluster. The content of anthocyanin in root, stem, leaf and flower of Tartary buckwheat at flowering stage and the expression of FtWD40 gene showed that the anthocyanin content and the gene expression of FtWD40 had the same tissue specificity, and the correlation coefficient between them was 0.875 (P0.05). Under cold stress and UV-B stress, the correlation coefficients between anthocyanin content and FtWD40 gene expression of Tartary buckwheat at bud stage were r = 0.785 (P0.05) and r ~ (0.891) (P0.05), respectively. These results suggested that FtWD40 might be involved in the regulation of anthocyanin synthesis of Tartary buckwheat. The eukaryotic expression vector of pBridge-FtWD40 was constructed and the transformed yeast AH109, was screened by SD/-Trp/-His double deficiency culture to obtain positive transformants. The activity of 尾-galactosidase in yeast single hybrid system was analyzed by filter paper. The results showed that FtWD40 protein had transcriptional activation activity. 3. PECMBIA1301-FtWD40 plant expression vector was constructed and transformed into tobacco callus by Agrobacterium tumefaciens. Furthermore, the anthocyanin content in the positive transgenic tobacco and the expression of NtPAL,NtCHS,NtANS,NtDFR,NtFLS and NtF3'H in the anthocyanin synthesis pathway were determined and analyzed. The anthocyanin content in T-1T-2 and T-3 lines of FtWD40 transgenic tobacco was increased, respectively. It was 3.45 times and 3.24 times as much as that of control (P0.01). At the same time, the results of qRT-PCR showed that there was no significant change in the expression of NtCHS and NtF3'H (P0.05). The expression of NtDFR and NtANS increased by 1.95 times and 1.56 times of the control group (P0.01), while the expression of FLS decreased to 0.79 times of the control group (P0.05). These results suggest that FtWD40 can enhance anthocyanin synthesis in transgenic tobacco.
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2;S517

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