【摘要】：研究背景及目的結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率分別位于惡性腫瘤的第三位和第四位。我國結(jié)直腸癌的死亡率也高居于惡性腫瘤死亡率的第四、五位之間,并呈增加的趨勢,已嚴重危害人類的生命健康。結(jié)直腸癌在分子形成機制和病理學形態(tài)上都呈現(xiàn)高異質(zhì)的特點,這對結(jié)直腸癌的診斷、治療方案的選擇、預后的評估是一個巨大的挑戰(zhàn)。從分子生物學的角度看,腫瘤是由于某些染色體上的DNA損傷致使細胞內(nèi)基因異常表達,導致細胞生長失控、缺乏分化而異常增生的一類復雜遺傳性疾病。研究腫瘤基因表達譜、選取特征信息基因是解釋腫瘤發(fā)生發(fā)展機制,尋找治療靶點和預后標記的最直接手段。因此本研究旨在研究結(jié)直腸癌腫瘤組織與正常組織的基因表達譜,挑選差異表達基因,構(gòu)建結(jié)直腸癌鑒別診斷模型;將非監(jiān)督聚類分析與遺傳學分析相結(jié)合,對結(jié)直腸癌進行分型,并分析不同分型的基因表達模式及其與臨床病理指標的相關(guān)性;嘗試用預后指數(shù)對結(jié)直腸癌患者進行預后評估,并建立預后指數(shù)分級,比較預后指數(shù)分級與經(jīng)典TNM分期在預后評判上的差別;嘗試構(gòu)建TNM分期和預后指數(shù)分級聯(lián)合預測模型進行預后評估。材料與方法收集2006年9月到2012年2月在某醫(yī)院確診并接受手術(shù)治療的127例結(jié)直腸癌患者,收集其術(shù)后切除的結(jié)直腸癌組織和正常組織標本,同時收集包括性別、手術(shù)時的年齡、腫瘤發(fā)生的位置、手術(shù)時局部浸潤情況、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移等資料。選取6對結(jié)直腸癌腫瘤組織和正常組織進行轉(zhuǎn)錄測序,在差異表達的基因中,選取表達差異倍數(shù)大于10的97個基因,然后進行擴大樣本驗證,最終挑選出差異表達顯著、方向與測序一致的75個基因進行后續(xù)研究。采用壽命表法計算累積生存率,Kaplan-Meier法進行單因素生存分析;采用Cox比例風險回歸模型進行多因素生存分析,根據(jù)Cox比例風險回歸模型給出的回歸系數(shù)計算每個患者的預后指數(shù);采用Logistic回歸模型對二分類觀察結(jié)局數(shù)據(jù)進行多因素分析;采用χ2檢驗或者Fisher's精確檢驗進行組間構(gòu)成比比較;采用Wilcoxon秩和檢驗對獨立非正態(tài)數(shù)據(jù)進行比較分析;采用ROC曲線分析評價LASSO回歸模型和Logistic回歸預測模型的特異度和靈敏度;采用ROC曲線分析評價預后指數(shù)在生存評判中的價值;采用非監(jiān)督聚類方法進行分型研究。研究結(jié)果本研究發(fā)現(xiàn)與RNA-seq結(jié)果一致的75個結(jié)直腸癌腫瘤組織和正常組織差異表達基因中有13個基因的表達與結(jié)直腸癌患者預后相關(guān),CPNE8、LOC646627、CDKN2A、ATP6V1A、CA1、SCARA5、BEST4、SCNN1B、KLF9 的高表達對預后不利,DNMT3B、ANLN、DNMT1、DNMT3A的高表達對病人預后有利。將以上13個基因納入到Cox比例風險回歸模型進行多因素分析后發(fā)現(xiàn)有5個基因與患者預后獨立相關(guān):DNMT3B的高表達對預后獨立有利,LOC646627、SCARA5、CDKN2A、ATP6V1A的高表達對預后獨立不利。將LASSO分析應用于多元線性回歸模型,挑選出18個結(jié)直腸癌特征基因(MLH1、PLOD3、TGM2、ATP6V1A、SQLE、MET、S100P、MT1M、BEST4、CA7、LOC646627、ANPEP、P2RX1、FOXF2、GAB3、ABI3BP、SCARA5、ADAMDEC1),利用這18個基因構(gòu)建的結(jié)直腸癌鑒別診斷模型可以將腫瘤組織和正常組織區(qū)分開,特異度為96.85%,靈敏度為98.43%,準確度達97.6%。本研究分別用75個差異表達基因、13個預后相關(guān)基因、5個預后獨立相關(guān)基因?qū)?27例結(jié)直腸癌患者進行聚類分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)用13個基因和5個基因都可以將患者分成預后不同的兩類,但當校正年齡、性別及TNM分期之后,發(fā)現(xiàn)5個基因的聚類結(jié)果仍與患者預后相關(guān),其中DNMT3B在第一分型中高表達,SCARA5、LOC646627、CDKN2A在第二分型中高表達,并且第一分型的預后優(yōu)于第二分型。利用Cox比例風險回歸模型提供的回歸系數(shù)計算127例患者的預后指數(shù),對患者進行預后評估。發(fā)現(xiàn)用5個預后獨立相關(guān)基因計算的預后指數(shù)(PI-5gene),對患者1年、3年、5年生存情況的評判與13個預后相關(guān)基因計算的預后指數(shù)(PI-13gene)無異,但優(yōu)于TNM分期。PI-5gene評判患者1年、3年、5年生存情況的曲線下面積分別為0.719、0.772、0.772。將PI-5gene與TNM分期聯(lián)合構(gòu)建聯(lián)合預測因子評判患者1年、3年、5年生存情況,比單用TNM分期分別增加20.98%、29.51%、26.77%的曲線下面積。將預后指數(shù)分級加入到TNM分期預后預測模型中,通過不基于風險等級的重分類改善指數(shù)(cfNRI)評價預后指數(shù)分級的實際生存預測能力,發(fā)現(xiàn)預后指數(shù)分級的加入可以顯著改善模型的1年、3年、5年預后預測能力(P0.001),cfNRI 分別為 0.381、0.507 和 0.465。研究結(jié)論利用LASSO篩選出的結(jié)直腸癌特征基因,同時構(gòu)建結(jié)直腸癌鑒別診斷模型,對腫瘤組織和正常組織的區(qū)分具有較高的準確性,并且該模型的特異度、靈敏度及準確度均高于傳統(tǒng)的Logistic回歸預測模型。基于結(jié)直腸癌腫瘤組織和正常組織的差異基因表達譜,用非監(jiān)督聚類方法可以對結(jié)直腸癌進行分型研究,分型結(jié)果對結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展具有一定的解釋力。我們建立的預后指數(shù)在評判結(jié)直腸癌患者術(shù)后1年、3年、5年生存情況時具有較高的準確性;在此基礎(chǔ)上建立的預后指數(shù)分級較TNM分期在預后評判上有更高的準確性;聯(lián)合TNM分期與預后指數(shù)分級對患者的預后評價更加全面和準確。
[Abstract]:Background and Objective Colorectal cancer is one of the most common malignant tumors in the world. The morbidity and mortality of colorectal cancer rank the third and fourth in malignant tumors respectively. Colorectal cancer is characterized by high heterogeneity in molecular formation mechanism and pathological morphology, which is a great challenge to the diagnosis, treatment and prognosis of colorectal cancer. The study of tumor gene expression profiles and the selection of characteristic information genes are the most direct means to explain the mechanism of tumorigenesis and development and to find therapeutic targets and prognostic markers. Differentially expressed genes were used to construct the differential diagnosis model of colorectal cancer; unsupervised clustering analysis and genetic analysis were combined to classify colorectal cancer, and the gene expression patterns of different types and their correlation with clinicopathological indexes were analyzed; prognostic index was used to evaluate the prognosis of colorectal cancer patients, and prognostic index was established. Methods 127 patients with colorectal cancer who were diagnosed and treated in a hospital from September 2006 to February 2012 were collected and their postoperative colorectal resection colorectal cancer were collected. Six pairs of colorectal cancer tissues and normal tissues were transcribed and sequenced, and the differentially expressed genes were selected. Seventy-seven genes larger than 10 were selected and validated by enlarged sample. Seventy-five genes with significant difference in expression and consistent direction and sequence were selected for follow-up study. The regression coefficients given by the case risk regression model were used to calculate the prognostic indices of each patient; Logistic regression model was used to analyze the multivariate analysis of binary observation outcome data; _2 test or Fisher's exact test was used to compare the composition ratio among groups; Wilcoxon rank sum test was used to compare and analyze the independent non-normal data; and R. OC curve analysis was used to evaluate the specificity and sensitivity of LASSO regression model and Logistic regression prediction model; ROC curve analysis was used to evaluate the value of prognostic index in survival assessment; unsupervised clustering was used to classify colorectal cancer tissues. The results of this study showed that 75 colorectal cancer tissues and normal groups were consistent with the results of RNA-seq. The overexpression of 13 genes was associated with the prognosis of colorectal cancer patients. The overexpression of CPNE8, LOC646627, CDKN2A, ATP6V1A, CA1, SCARA5, BEST4, SCNN1B, KLF9 was unfavorable to the prognosis of colorectal cancer patients. The overexpression of DNMT3B, ANLN, DNMT1, DNMT3A was beneficial to the prognosis of colorectal cancer patients. Five genes were independently associated with prognosis: high expression of DNMT3B was independently associated with prognosis, and high expression of LOC646627, SCARA5, CDKN2A, ATP6V1A was independently associated with prognosis. LASSO analysis was applied to multiple linear regression model to select 18 colorectal cancer characteristic genes (MLH1, PLOD3, TGM2, ATP6V1A, SQLE, MET, S100P, MT1M, BEST4, C). A7, LOC646627, ANPEP, P2RX1, FOXF2, GAB3, ABI3BP, SCARA5, ADAMDEC1 were used to construct a differential diagnosis model for colorectal cancer. The specificity, sensitivity and accuracy of the model were 96.85%, 98.43% and 97.6% respectively. Seventy-five differentially expressed genes, 13 prognostic-related genes and 5 prognosis-related genes were used in this study. Cluster analysis of 127 patients with colorectal cancer by independent related genes showed that 13 genes and 5 genes could be used to classify the patients into two groups with different prognosis. However, when adjusted for age, sex and TNM stage, the clustering results of 5 genes were still related to the prognosis of patients. DNMT3B was highly expressed in the first type, SCARA5 and LOC were high in the first type. 646627, CDKN2A was highly expressed in the second subtype, and the prognosis of the first subtype was better than that of the second subtype. PI-5 gene was superior to TNM staging in predicting 1 year, 3 years, and 5 years survival. The sub-curve scores of PI-5 gene and TNM staging were 0.719, 0.772 and 0.772, respectively. The prognostic index classification was added to the TNM prognostic prediction model. The actual survival prediction ability of the prognostic index classification was evaluated by the non-risk-based reclassification improvement index (cfNRI). It was found that the prognostic index classification could significantly improve the one-year, three-year, and five-year survival prediction ability of the model. The annual prognostic predictive ability (P 0.001) and cfNRI were 0.381, 0.507 and 0.465, respectively. Conclusion LASSO screening of colorectal cancer characteristic genes, and the construction of colorectal cancer differential diagnosis model, tumor tissue and normal tissue with high accuracy, and the specificity, sensitivity and accuracy of the model are higher than the traditional ones. Logistic regression model. Based on the differential gene expression profiles of colorectal cancer tissues and normal tissues, unsupervised clustering method can be used to classify colorectal cancer. The typing results have some explanatory power for the occurrence and development of colorectal cancer. The prognostic indices were more accurate than TNM staging, and the prognostic evaluation combined with TNM staging and prognostic index grading was more comprehensive and accurate.
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

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