【摘要】：牛病毒性腹瀉／黏膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease, BVD-MD)是由牛病毒性腹瀉／粘膜病病毒(BVDV)引發(fā)的牛的一種傳染病。該病主要發(fā)生于牛,犢牛更易感,還可感染其它動物,主要引起牛腹瀉,急、慢性粘膜病,持續(xù)性感染與免疫耐受,母畜流產(chǎn)和死胎等,給養(yǎng)牛業(yè)的經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重的損失。為了調(diào)查寧夏地區(qū)牛病毒性腹瀉/粘膜病的流行病學(xué)及分子流行病學(xué)情況,掌握該病在寧夏地區(qū)的流行狀況,本試驗運(yùn)用ELISA方法對寧夏BVDV的感染及流行情況進(jìn)行調(diào)查。并在此基礎(chǔ)上對血清學(xué)陽性牛進(jìn)行分子生物學(xué)跟蹤檢測,以獲得BVDV地方分離株。本研究對送到實驗室檢測的326份血清樣品和278份耳組織樣品,運(yùn)用BVDV抗體ELISA檢測試劑盒對血清樣品進(jìn)行抗體檢測,對耳組織樣品使用BVDV抗原ELISA檢測試劑盒進(jìn)行抗原檢測。對送檢樣品BVDV血清學(xué)的研究。檢測結(jié)果顯示,326份血清樣品的BVDV抗體陽性率為90.2%,278份耳組織樣品的BVDV抗原陽性率為0.3%。檢測結(jié)果表明寧夏地區(qū)送檢的樣品中BVDV抗體陽性率很高,可能是因為送檢的都是具有腹瀉、流產(chǎn)等癥狀的樣品有關(guān)。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對診斷出的抗原陽牛進(jìn)行病毒分離,并順利獲得牛病毒性腹瀉病毒分離株,命名為BVDV-NX。該分離株在MDBK細(xì)胞系上進(jìn)行增殖培養(yǎng),出現(xiàn)空斑、拉網(wǎng)和脫落等一系列典型的細(xì)胞病變(CPE)。隨后收集病毒液,提取病毒總RNA并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得BVDV-NX毒株cDNA.利用PCR方法對5'-UTR基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和測序,應(yīng)用MEGA6分析軟件,選擇N-J(Neighbor-Joining)方法繪制遺傳進(jìn)化樹,這株BVDV-NX屬于BVDV基因1b型。根據(jù)NCBI上已發(fā)表的BVDV-EO基因序列設(shè)計一對特異性引物,利用PCR方法擴(kuò)增出710bp的E0基因,進(jìn)行測序及序列分析。將PCR擴(kuò)增的E0基因克隆入原核表達(dá)載體pET-32a,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行雙酶切鑒定,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-E0,為進(jìn)一步的試驗奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Bovine viral diarrhea / mucosal disease (BVD-MD) is an infectious disease caused by bovine viral diarrhea / mucosal disease virus (BVDV). The disease mainly occurs in cattle, calves are more susceptible to infection, but also can infect other animals, mainly causes bovine diarrhea, acute, chronic mucosal disease, persistent infection and immune tolerance, female abortion and stillbirth, and so on, causing serious economic losses to the cattle industry. In order to investigate the epidemiology and molecular epidemiology of bovine viral diarrhea / mucosal disease in Ningxia and to know the epidemic situation of the disease in Ningxia, the ELISA method was used to investigate the infection and prevalence of BVDV in Ningxia. On the basis of this, the seropositive cattle were tracked by molecular biology to obtain the local isolates of BVDV. In this study, 326 serum samples and 278 ear tissue samples sent to the laboratory were detected by BVDV antibody ELISA assay kit, and BVDV antigen ELISA kit was used to detect the antigen of ear tissue samples. Study on BVDV serology of sample. The results showed that the positive rate of BVDV antibody in 326 serum samples was 90.2and the positive rate of BVDV antigen in 278 ear tissue samples was 0.3%. The results showed that the positive rate of BVDV antibody was very high in the samples from Ningxia area, which may be related to the samples with diarrhea, abortion and other symptoms. Using cell culture technique, the virus was isolated from the diagnosed antigen, and the isolated strain of bovine viral diarrhea virus was successfully obtained, which was named BVDV-NX. The isolate was cultured on MDBK cell lines and showed a series of typical cytopathic (CPE)., such as plaque, mesh drawing and shedding. Then the virus solution was collected, the total RNA of the virus was extracted and the BVDV-NX strain cDNA was obtained by reverse transcription. The 5'-UTR gene fragment was amplified and sequenced by PCR method. N-J (Neighbor-Joining) method was selected to map the genetic evolution tree using MEGA6 analysis software. The BVDV-NX belongs to BVDV gene 1b type. According to the published sequence of BVDV-EO gene in NCBI, a pair of specific primers were designed. The E0 gene of 710bp was amplified by PCR method and sequenced. The E0 gene amplified by PCR was cloned into the prokaryotic expression vector pET-32a and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) for double digestion to construct the prokaryotic expression vector pET-32a-E0, which laid a foundation for further experiments.
【學(xué)位授予單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：2193542