【摘要】：NAC(NAM、ATAF1/2、CUC)轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子,它不僅參與植物的多個生長發(fā)育過程,還參與植物對生物以及非生物脅迫的響應。本實驗室前期從鹽生植物遼寧堿蓬(Suaeda liaotungensis K.)中克隆了一個NAC轉錄因子SlNAC2,并獲得了轉SlNAC2擬南芥T2代種子。本研究以轉SlNAC2擬南芥T2代種子為實驗材料,篩選出轉基因擬南芥T3代純合二倍體,并對轉基因純合二倍體植株進行非生物脅迫抗性及機制分析。主要結果如下:1.以實驗室前期獲得的轉pBI121-SlNAC2擬南芥和轉pBI121-GUS擬南芥T2代種子為材料,利用含卡那霉素(100 mg/L)的MS培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng),獲得轉pBI121-SlNAC2擬南芥純合二倍體株系:L1、L2、L3;轉pBI121-GUS擬南芥純合二倍體株系:VT1、VT2。半定量RT-PCR分析表明,SlNAC2基因已在轉SlNAC2基因擬南芥中表達。2.非生物脅迫(干旱、高鹽、低溫)條件下,對轉基因擬南芥及野生型擬南芥進行形態(tài)和生理特征分析,形態(tài)指標主要包括:存活率、種子萌發(fā)率、根部發(fā)育、組織含水量和氣孔;生理指標主要包括:葉綠素熒光、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、電導率及抗氧化酶活性等。非生物脅迫下,兩種擬南芥萌發(fā)均受到明顯抑制,但轉pBI121-SlNAC2株系萌發(fā)率明顯優(yōu)于野生型與轉pBI121-GUS株系。在幼苗生長階段,非生物脅迫下的存活率、根部發(fā)育、組織含水量和氣孔的結果顯示,轉pBI121-SlNAC2株系比野生型和轉pBI121-GUS株系具有更好的生存能力。非生物脅迫下葉綠素熒光與可溶性蛋白含量的變化表明,轉基pBI121-SlNAC2擬南芥通過提高光合作用來應對非生物脅迫。轉pBI121-SlNAC2基因擬南芥在非生物脅迫下的脯氨酸含量及抗氧化酶活性顯著高于野生型與轉pBI121-GUS擬南芥,且細胞膜的損傷程度要低于野生型與轉pBI121-GUS擬南芥。結果表明,外源SlNAC2基因在擬南芥中表達,提高了擬南芥的抗逆境能力,在很大程度上減少了非生物脅迫對轉基因擬南芥的損害。有效的證明了SlNAC2基因具有提高擬南芥對非生物脅迫耐受性的能力。3.利用安捷倫基因芯片分析轉SlNAC2基因擬南芥與野生型擬南芥差異表達基因,并通過實時熒光定量PCR方法對部分差異表達基因進行驗證。差異表達分析結果顯示,在轉SlNAC2基因擬南芥中共篩選到1258個差異表達基因,其中上調表達的基因706個,下調表達基因552個。差異倍數(shù)大于50倍的基因22個,GO分類結果顯示,這些基因主要參與植物細胞的生長發(fā)育、激素信號傳遞、酶活性的調控以及脅迫響應過程中涉及的離子轉運、抗氧化劑的合成、轉錄因子的相互作用等復雜的生理生化過程。差異表達基因包括MYB、WRKY類轉錄因子基因,并且存在與精氨酸和脯氨酸有關的信號通路基因。SlNAC2是NAC轉錄因子家族成員之一,通過調控下游脅迫相關的基因提高轉基因擬南芥在非生物脅迫下的耐受性。本研究揭示了SlNAC2在提高植物抗逆性中的作用,初步分析了其調控的下游基因,為植物抗逆機理研究提供了新資料。
[Abstract]:NAC (NAM, ATAF 1/2, CUC) transcription factors are plant-specific transcription factors. NAC transcription factors not only participate in many plant growth and development processes, but also participate in plant responses to biological and abiotic stresses. In this study, T3 homozygous diploids of transgenic Arabidopsis thaliana were screened from the seeds of T2 generation of transgenic Arabidopsis thaliana SlNAC2, and the abiotic stress resistance and mechanism of transgenic homozygous diploid plants were analyzed. The main results were as follows: 1. The transgenic Arabidopsis thaliana pBI121-SlNAC2 and transgenic pBI121-GUS were obtained in the early stage of the laboratory. Transgenic Arabidopsis thaliana homozygous diploid lines: L1, L2, L3 and pBI121-GUS homozygous diploid lines: VT1, VT2. Semi-quantitative RT-PCR analysis showed that SlNAC2 gene was expressed in transgenic Arabidopsis thaliana. The morphological and physiological characteristics of transgenic Arabidopsis and wild Arabidopsis thaliana under drought (drought, high salinity, low temperature) stress were analyzed. The morphological indexes mainly included survival rate, seed germination rate, root development, tissue water content and stomata; physiological indexes mainly included chlorophyll fluorescence, soluble protein content, proline content, electrical conductivity and resistance. The germination rate of transgenic pBI121-SlNAC2 was significantly higher than that of wild-type and trans-pBI121-GUS strains. At seedling growth stage, the survival rate, root development, tissue water content and stomata of trans-pBI121-SlNAC2 strains were higher than that of wild-type. The changes of chlorophyll fluorescence and soluble protein content under abiotic stress indicated that the transgenic Arabidopsis thaliana pBI121-SlNAC2 could cope with abiotic stress by increasing photosynthesis. The results showed that the expression of exogenous SlNAC2 gene in Arabidopsis improved the stress resistance of Arabidopsis thaliana and reduced the damage of transgenic Arabidopsis to a great extent. Genes have the ability to improve the tolerance of Arabidopsis to abiotic stress. 3. Differentially expressed genes of transgenic Arabidopsis thaliana and wild type Arabidopsis thaliana were analyzed by Agilent microarray, and some differentially expressed genes were verified by real-time fluorescence quantitative PCR. A total of 1,258 differentially expressed genes were screened, of which 706 were up-regulated and 552 were down-regulated. 22 genes were more than 50-fold differentially expressed. GO classification showed that these genes were mainly involved in plant cell growth and development, hormone signaling, enzyme activity regulation and ion transport involved in stress response. Differentially expressed genes include MYB and WRKY transcription factor genes, and there are signal transduction genes associated with arginine and proline. SlNAC2 is a member of the NAC transcription factor family that enhances transgenic mimicry by regulating downstream stress-related genes. This study revealed the role of SlNAC2 in improving stress tolerance of Arabidopsis thaliana under abiotic stress, and preliminarily analyzed the downstream genes regulated by SlNAC2, which provided new information for the study of stress resistance mechanism of plants.
【學位授予單位】：遼寧師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

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