【摘要】：毛竹是中國主要的用材竹種,纖維素的合成是竹材形成的必要條件。纖維素主要由纖維素合成酶(Cellulose synthase,Ces A)合成,并儲存在植物的初生壁和次生壁中。因此,研究纖維素合成酶的結構與功能對毛竹生長發(fā)育以及纖維素的利用有重要指導意義。本研究以毛竹生長過程中不同時期的5個高度(10cm、30cm、120cm、600cm、1400cm)的毛竹為研究材料,其中10cm和30cm時為毛竹生長初期,120cm為毛竹生長上升期,600cm左右為毛竹生長盛期,1400cm時毛竹開始抽枝展葉,為生長末期,通過生物信息學方法、生物顯微鏡觀察、透射電鏡觀察、熒光定量PCR、RNA原位雜交、Western Blot、蛋白質的體外表達等方法研究了毛竹纖維素合成酶基因的表達和功能。所得結論如下:(1)毛竹莖稈結構顯微觀察表明毛竹生長發(fā)育分為四個時期,第一個時期,細胞未分化期,沒有明顯的組織結構,此時的細胞主要以分裂產生更多的細胞為主。第二個時期,原生結構形成期,有典型的維管束結構出現,但密度較大,結構較小,韌皮部細胞分化不明顯,纖維細胞和薄壁細胞的界限不明確。第三個時期,維管束結構成熟期,纖維細胞和薄壁細胞的界限明確,有兩個典型的后生木質部導管,韌皮部結構明顯。第四個時期,纖維細胞木質化時期,可以看到纖維細胞周圍一層深色物質�；康睦w維組織最先出現木質化,此時為毛竹生長的上升期,莖稈的高度大約為120cm。(2)毛竹韌皮部細胞超微結構觀察發(fā)現,毛竹生長發(fā)育過程可分為初生壁形成期,次生壁形成期,以及次生壁加厚期。研究表明次生壁隨著高度的增加而加厚,上升期(120cm)的毛竹基部可觀察到次生壁出現,盛期(600cm)的毛竹中部和基部有次生壁結構,頂部和根部僅有初生壁,末期(14m)毛竹基部次生壁比盛期厚。(3)生物信息學分析表明,毛竹纖維素合成酶家族基因共有16個成員,結構域分析表明,毛竹纖維素合成酶都含有cellulose_synt結構域,N端大多有Zn指結構,毛竹纖維素合成酶超家族成員有48個,分為5個亞家族,分別是CESA、CSLD、CSLE、CSLF、CSLH。系統(tǒng)進化分析表明,Ces A基因極有可能在單、雙子葉植物分化前就已經出現分化。祖先狀態(tài)時,毛竹中的纖維素合成酶基因就比擬南芥和水稻多。物種分化之后,毛竹纖維素合成酶基因也單獨發(fā)生了多次重復事件,產生了更多的基因拷貝數,這可能和毛竹獨特的快速生長特性有關。(4)在前人對毛竹莖稈中纖維素含量的研究基礎上,結合顯微和超微觀察結果以及定量表達結果進行分析發(fā)現,在初生壁形成的部位,3個基因(PeCesA6、PeCesA9和PeCesA13)表達最顯著。在次生壁形成的部位,毛竹纖維素合成酶基因家族成員的8個基因(PeCesA1、PeCesA2、PeCesA3、PeCesA4、PeCesA5、PeCesA6、PeCesA9、和PeCesA13)表達均非常顯著。推測PeCesA6、PeCesA9、PeCesA13對初生壁和次生壁的形成都起到重要作用,而PeCesA1、PeCesA2、PeCesA3、PeCesA4、PeCesA5基因主要參與毛竹次生壁的合成。(5)毛竹纖維素合成酶保守結構域體外表達的蛋白為包涵體,經Western blot檢測后確定為該蛋白的表達,表達產物的分子量為33KDa,p I為7.4。
[Abstract]:Phyllostachys pubescens are the main timber species in China. The synthesis of cellulose is a necessary condition for the formation of bamboo. Cellulose is mainly synthesized by Cellulose synthase (Ces A) and stored in the primary wall and secondary wall of the plant. Therefore, the structure and function of cellulose synthase have been studied for the growth and development of Phyllostachys pubescens and the use of cellulose. This study uses 5 height (10cm, 30cm, 120cm, 600cm, 1400cm) of Phyllostachys pubescens in the growth process of Phyllostachys pubescens as the research materials, in which 10cm and 30cm are the initial growth period of Phyllostachys pubescens, 120cm is the growth period of Phyllostachys pubescens, and 600cm is the growth stage of the bamboo, while 1400cm starts to branch out, for the end of growth and through biology. The methods of Informatics, biological microscopy, transmission electron microscopy, fluorescence quantitative PCR, RNA in situ hybridization, Western Blot, protein expression and other methods were used to study the expression and function of the gene of bamboo cellulose synthase. The conclusions are as follows: (1) the growth and development of Phyllostachys pubescens are divided into four periods, the first one is the first one. During the undifferentiated period of the cells, there was no obvious tissue structure. At this time, the cells were mainly divided to produce more cells mainly. Second periods, the primary structure formation period, the typical vascular bundle structure appeared, but the density was large, the structure was small, the phloem cell differentiation was not obvious, and the boundaries of the fibroblast and parenchyma cells were not clear. Third During the period of the mature period of vascular bundle structure, the boundaries of fibroblast and parenchyma cells are clear, there are two typical posterior xylem ducts and the phloem structure is obvious. In the fourth period, the fiber cells lignification period can see the dark substance around the fiber cells. The fibrous tissue of the base is first lignification, at this time it is the growth of Phyllostachys pubescens. The height of the stem is about 120cm. (2) in the phloem ultrastructure of the Phyllostachys pubescens. It is found that the process of growth and development of bamboo can be divided into primary wall formation period, secondary wall formation period, and secondary wall thickening period. The secondary wall thickens with the height increase, and secondary wall can be observed in the base of the up period (120cm). There are secondary wall structures in the middle and base of 600cm, the top and the root are only primary wall, and the secondary wall of the base of bamboo is more thick than that in the end (14m). (3) bioinformatics analysis shows that there are 16 members of the Phyllostachys pubescens cellulose synthase family gene. The analysis of the Phyllostachys pubescens cellulose synthase contains the cellulose_synt domain and the N end. Most of them have Zn finger structure. There are 48 superfamily members of Phyllostachys pubescens cellulose synthase superfamily, which are divided into 5 subfamilies. The phylogenetic analysis of CESA, CSLD, CSLE, CSLF, CSLH. shows that the Ces A gene is very likely to be differentiated before the differentiation of the dicotyledonous plants. The cellulose synthase genes in the forefathers were compared to the southern mustard and water. After species differentiation, the Phyllostachys pubescens cellulose synthetase gene has also been repeated several times, producing more copies of the gene, which may be related to the unique rapid growth characteristics of bamboo. (4) on the basis of previous studies on cellulose content in bamboo stems, combined with microscopic and ultramicro observation results and quantitative expression junctions. The 3 genes (PeCesA6, PeCesA9 and PeCesA13) expressed most significantly at the site of primary wall formation, and 8 genes (PeCesA1, PeCesA2, PeCesA3, PeCesA4, PeCesA5, PeCesA6, PeCesA9, and PeCesA13) were very significant in the parts of the secondary wall formation. PeCesA13 plays an important role in the form of primary wall and secondary wall of Chengdu, while PeCesA1, PeCesA2, PeCesA3, PeCesA4, PeCesA5 genes are mainly involved in the synthesis of the secondary wall of Phyllostachys pubescens. (5) the protein expressed in the conservative domain of bamboo cellulose synthase is inclusion body, which is determined by Western blot as the expression of the protein and the molecule of the expression product. The amount is 33KDa, and P I is 7.4.
【學位授予單位】：浙江農林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;S795.7

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本文編號：2171757