【摘要】：口蹄疫病毒(FMDV)除引起偶蹄動物蹄部和唇部的水泡外還能引起幼齡動物急性心肌炎導致其死亡,目前對FMDV致心肌炎的動物模型及其分子機制缺乏研究。本研究通過FMDV感染乳鼠后心臟冰凍切片及石蠟切片的H.E染色、心肌透射電鏡觀察、FMDV和纖維連接蛋白(Fn)免疫組化分析、心臟組織FMDV特異性目的基因RT-PCR擴增、心臟研磨上清炎性相關因子定量檢測等技術手段證實FMDV感染乳鼠36h可引起急性心肌炎。乳鼠表現(xiàn)為死亡,病理變化為心臟染色可見心肌大量炎性細胞浸潤,透射電鏡可見FMDV致乳鼠心肌細胞線粒體腫大、肌節(jié)走向紊亂、心肌纖維溶解,免疫組化及其灰度分析證實心臟中有FMDV復制,心肌中FN蛋白過量表達。乳鼠心肌細胞體外培養(yǎng)實驗和FMDV感染實驗表明,FMDV在體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞中無法復制。本研究建立的FMDV感染乳鼠心肌炎動物模型及其心肌細胞的體外培養(yǎng)為FMDV致心肌炎分子機制的研究奠定了基礎。數(shù)字基因表達譜(DGE)是一種可快速、全面地測定某一物種特定組織在實驗狀態(tài)下基因表達情況的高通量測序技術,目前DGE技術已經(jīng)在藥物研發(fā)、醫(yī)學研究和基礎科學研究等領域得到廣泛應用。迄今為止未見DGE在FMD病毒性心肌炎研究中的報道,根據(jù)第一章研究結果證實FMDV可以引起乳鼠心肌炎,那么FMDV感染導致乳鼠心臟組織的哪些基因發(fā)生了差異表達?這些差異表達的基因在病毒性心肌炎中扮演的可能角色是什么?為此本研究在建立了FMDV致乳鼠心肌炎動物模型的基礎上,利用DGE技術對感染組乳鼠和對照組乳鼠心臟進行了數(shù)字基因差異表達分析。結果發(fā)現(xiàn)感染組和對照組相比總共有3141個基因發(fā)生了差異表達,其中有2735個基因上調表達、406個基因發(fā)生了下調表達,在所有差異表達的基因中和病毒性心肌炎pathway相關的有47個基因,對這條通路中的部分基因進行了qRT-PCR驗證和western-blot驗證,本研究結果為進一步研究FMDV致乳鼠心肌炎的分子機制提供了依據(jù),也為FMDV致其他偶蹄幼齡動物心肌炎研究提供了思路。
[Abstract]:Foot-and-mouth disease virus (FMDV) (FMDV) not only causes blisters in hoof and lip of cloven-hoofed animals, but also causes acute myocarditis in young animals. At present, there is little research on the animal model and its molecular mechanism of myocarditis induced by FMDV. The aim of this study was to observe the immunohistochemical analysis of FMDV and fibronectin (Fn) by means of H. E staining in frozen and paraffin sections of heart after FMDV infection. The specific target gene of FMDV was amplified by RT-PCR in heart tissue. Quantitative detection of inflammatory factors in the supernatant of heart grinding confirmed that FMDV infection could cause acute myocarditis in neonatal rats for 36 h. The pathological changes were myocardial inflammatory cell infiltration. Transmission electron microscope showed that the myocardial mitochondria were enlarged, the sarcomere was disordered, and the myocardial fiber was dissolved. Immunohistochemistry and gray analysis confirmed FMDV replication in the heart and overexpression of FN protein in the myocardium. In vitro culture of neonatal rat cardiomyocytes and FMDV infection test showed that FMDV could not be duplicated in cultured neonatal rat cardiomyocytes. The animal model of myocarditis induced by FMDV and the culture of cardiomyocytes in vitro laid a foundation for the study of the molecular mechanism of myocarditis induced by FMDV. Digital gene expression profile (DGE) is a high-throughput sequencing technique that can rapidly and comprehensively determine the expression of genes in a particular tissue of a species under experimental conditions. At present, DGE technology has been developed in drug research and development. Medical research and basic scientific research and other fields have been widely used. DGE has not been reported in the study of FMD viral myocarditis so far. According to the results of the first chapter, it has been confirmed that FMDV can cause myocarditis in neonatal rats. So which genes have been differentially expressed in the heart tissue of neonatal rats caused by FMDV infection? What is the possible role of these differentially expressed genes in viral myocarditis? On the basis of establishing the animal model of neonatal myocarditis induced by FMDV, the differential expression of digital genes in the hearts of infected and control groups was analyzed by DGE technique. The results showed that a total of 3141 genes were differentially expressed in the infected group and the control group, among which 2735 genes were up-regulated and 406 genes were down-regulated. There are 47 genes associated with viral myocarditis in all differentially expressed genes and pathway. Some of the genes in this pathway were verified by qRT-PCR and western-blot. The results of this study provide a basis for further study on the molecular mechanism of FMDV induced myocarditis in neonatal rats, as well as ideas for the study of FMDV induced myocarditis in other cloven-hoofed young animals.
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：博士后
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：2168068