【摘要】：由水稻黑條矮縮病毒(Riceblack-streaked dwarf virus，，RBSDV)引起的水稻黑條矮縮病(Rice black-streaked dwarf disease)是由灰飛虱(Laodelphaxstriatellus)(SBPH)以持久性不經(jīng)卵傳的方式傳播的一種惡性病毒病,該病可導(dǎo)致水稻矮化、抽穗結(jié)實困難,嚴重的影響了水稻的產(chǎn)量。發(fā)掘抗性基因,通過改良水稻自身防衛(wèi)系統(tǒng)以培育抗性品種是有效預(yù)防該病害的重要策略。之前的研究中我們以淮稻5號/烏殼(RBSDV抗性品種)后代分離群體為對象,利用基于簡化基因組深度測序技術(shù)(SLAF-seq)構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜和人工接種鑒定分析獲取表型數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,精細定位出6個水稻黑條矮縮病的抗性QTL,本研究采用電子數(shù)據(jù)庫基因注釋、抗感材料基因篩查和轉(zhuǎn)基因功能驗證的方法對其中3個抗黑條矮縮病QTL(qRBSDV-6a、qRBSDV-6b和qRBSDV-6c)的進行研究,主要研究結(jié)果如下:1)本試驗綜合水稻全基因組測序數(shù)據(jù)庫、生物信息學(xué)和功能基因組學(xué)的方法,利用5個數(shù)據(jù)庫(COG、GO、KEGG、Swiss-Prot、nr)分子功能信息的基因測序報告,對水稻黑條矮縮病3個抗性QTL(qRBSD V-6a、qRBSDV-6b和qRBSDV-6c)進行初步篩選,根據(jù)目前已克隆的抗病毒基因的類型篩查出78個候選基因,包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,LRR受體蛋白激酶,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等。2)分別克隆感病粳稻品種淮稻5號和抗病秈稻品種烏殼中的候選基因,通過測序?qū)@78個基因的核苷酸和氨基酸的序列進行差異性的驗證分析,并對存在序列差異性的候選基因在NCBI和SMART等網(wǎng)站分析氨基酸的差異可能引起的功能變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)候選基因中有21個無核苷酸的差異,14個有核苷酸的差異但無氨基酸的差異,兩者的差異都存在但是突變不在蛋白功能區(qū)有18個,在淮稻5號或烏殼中多次設(shè)計引物仍擴不到正確的候選基因的有13個,核苷酸和氨基酸差異都存在且突變在蛋白功能區(qū)的有12個,包括蛋白激酶和蛋白受體,F-box結(jié)構(gòu)域,Myb轉(zhuǎn)錄因子等。同時,為進一步驗證了這12個候選基因氨基酸突變的穩(wěn)定性,對后代F2代極抗和極感群體進行單株克隆測序,發(fā)現(xiàn)兩者之間不但親本與后代F2代基因序列存在一致性,而且F2代極抗和極感群體仍存在穩(wěn)定的氨基酸差異。3)對已驗證的候選基因進行轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建,經(jīng)T4-DNA連接酶將目的基因連接到植物表達載體pCAMBIA1301上,并通過對重組質(zhì)粒的抗性篩選、PCR檢測,證實成功構(gòu)建了植物表達載體pCAMBIA 1301。為驗證目的基因在水稻中的功能,將12個候選基因轉(zhuǎn)入感病水稻植株淮稻5號,最后獲得8個轉(zhuǎn)基因水稻株系。對獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株,首先采用PCR對轉(zhuǎn)基因水稻植株(T0代)的選擇標記基因(潮霉素Hyg抗性)進行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶潮霉素抗性基因的比率在84.8%到100%之間;對攜帶Hyg的水稻進行目的基因的PCR檢測,比率達100%。單株收取T0代轉(zhuǎn)基因水稻的T1代種子,對T2轉(zhuǎn)基因苗株系的T1代種子進行RBSDV的接毒實驗,結(jié)果顯示每株苗的RBSDV含量都較高,帶毒率在68.2%-93.3%之間,部分T1代種子的帶毒率低于感病品種淮稻5號,最后還要進一步通過表型分析進行驗證轉(zhuǎn)基因水稻的抗性。由于RBSDV同樣引起中國玉米粗縮病和小麥}尋

本文編號：2121628