本文選題：八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 + 黑色素��； 參考：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)》2017年04期

【摘要】：【目的】克隆小鼠八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1(octamer-binding transcription factor 1,Oct-1)基因序列,探討八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1在小鼠黑素細(xì)胞中過表達(dá)對毛色主效基因表達(dá)的影響及在毛色形成中的作用�！痉椒ā渴褂脤�(shí)驗(yàn)室凍存的第5代小鼠黑素細(xì)胞,通過普通PCR方法用引物以小鼠黑素細(xì)胞c DNA為模板克隆Oct-1基因c DNA序列,構(gòu)建小鼠Oct-1克隆載體和真核表達(dá)載體;通過KEGG PATHWAY、NCBI、Transfec等軟件對獲得的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析;在細(xì)胞水平通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過量表達(dá)小鼠Oct-1;轉(zhuǎn)染后使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,采用分光光度計(jì)對小鼠黑素細(xì)胞中黑色素含量進(jìn)行測定,并進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后黑素細(xì)胞中毛色主效基因在m RNA水平表達(dá)量的變化,Western blot實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中MITF、TYR、TYRP-1和TYRP-2蛋白水平的變化。【結(jié)果】經(jīng)測序和拼接最終獲得長度為2 313 bp的小鼠Oct-1基因的c DNA序列;成功構(gòu)建真核表達(dá)載體,載體上連有小鼠黑素細(xì)胞特異性TYRP-2基因啟動子和一個(gè)啟動報(bào)告基因綠色熒光蛋白;通過KEGG PATHWAY分析獲得與毛色形成有關(guān)的34個(gè)候選基因,NCBI查找出34各個(gè)基因的啟動子,由Transfec啟動子分析軟件找出Oct-1可以調(diào)節(jié)的毛色主效基因;細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,在熒光顯微鏡下可觀察到黑素細(xì)胞帶有綠色熒光說明轉(zhuǎn)染效率明顯;分光光度計(jì)檢測顯示,轉(zhuǎn)染后小鼠黑素細(xì)胞中黑色素含量減少(P0.05);熒光定量檢測結(jié)果顯示,小鼠黑素細(xì)胞中Oct-1 m RNA表達(dá)量顯著增加(P0.001),表明小鼠Oct-1轉(zhuǎn)染效率顯著,MITF m RNA顯著降低至0.70倍(P0.01),TCF m RNA顯著降低至0.66倍(P0.01),Ras、Frizzled、ERK2和TYRP-2 m RNA的表達(dá)未見變化,TYR m RNA顯著增加至7.69倍(P0.01),TYRP-1 m RNA升高至3.11倍(P0.01),αMSH m RNA顯著增加至18.49倍(P0.001),AC m RNA顯著增加至6.88倍(P0.01),c-kit m RNA顯著增加至18.75倍(P0.001),ET1 m RNA增加至1.50倍(P0.05),ETB-R m RNA顯著增加至13.47倍(P0.001),CAM m RNA增加至1.46倍(P0.05);蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,小鼠黑素細(xì)胞中Oct-1轉(zhuǎn)染組MITF蛋白顯著降低至0.67倍(P0.01),TYR蛋白增加至1.16倍(P0.05),TYRP-1蛋白升高至1.15倍(P0.05),TYRP-2蛋白未見變化�！窘Y(jié)論】通過PCR和克隆技術(shù)及核酸測序技術(shù)獲得了小鼠Oct-1基因全長2 313 bp的CDS區(qū),經(jīng)生物信息學(xué)分析找出Oct-1作用的毛色主效基因,過表達(dá)Oct-1后使黑素細(xì)胞中MITF和TCF的表達(dá)降低,TYR、TYRP-1、αMSH、AC、c-kit、ET1、ETB-R和CAM的表達(dá)增加。證實(shí)Oct-1可調(diào)節(jié)毛色主效基因的表達(dá),參與黑色素合成的調(diào)節(jié),改變毛色。
[Abstract]:[objective] to clone mouse octamer binding transcription factor 1 (octamer-binding transcription factor 1) gene sequence. To investigate the effect of octamer binding transcription factor 1 (Octamer binding transcription factor 1) on the expression of major coat color genes in mouse melanocytes and the role of octamer binding transcription factor 1 in the formation of coat color. [methods] the fifth generation of mouse melanocytes, which were frozen in laboratory, was used. The cDNA sequence of Oct-1 gene was cloned by using mouse melanocyte c DNA as template by ordinary PCR method, and the cloned vector and eukaryotic expression vector of mouse Oct-1 were constructed, and the obtained sequences were analyzed by bioinformatics using KEGG PATHWAYA NCBITransfec software. After transfection, the transfection efficiency of mouse Oct-1 was observed by fluorescence microscope, and the melanin content in mouse melanocytes was measured by spectrophotometer. Real-time polymerase chain reaction was used to detect the expression of coat color major genes in melanocytes after transfection. Western blot assay was used to detect the changes of the protein levels of MITFTYROTYRP-1 and TYRP-2 in transfected melanocytes. [results] the results were obtained by sequencing and splicing. The cDNA sequence of mouse Oct-1 gene was obtained with the length of 2 313 BP. The eukaryotic expression vector was successfully constructed with mouse melanocyte specific TYRP-2 gene promoter and a priming reporter gene green fluorescent protein. By KEGG PATHWAY analysis, 34 candidate genes related to the formation of coat color were identified by NCBI, and the major color genes of Oct-1 were identified by Transfec promoter analysis software. Under fluorescence microscope, melanocytes with green fluorescence showed significant transfection efficiency; spectrophotometer showed that melanin content in mouse melanocytes decreased after transfection (P0.05); fluorescence quantitative analysis showed that, The expression of Oct-1 mRNA in mouse melanocytes was significantly increased (P0.001), indicating that the transfection efficiency of mouse Oct-1 was significantly reduced to 0.70 times (P0.01) and the expression of TCF mRNA significantly decreased to 0.66 times (P0.01). TYRP-1 mRNA increased to 3.11 fold (P0.01), 偽 MSH mRNA significantly increased to 18.49 fold (P0.001) to 6.88 times (P0.01) c-kit mRNA significantly increased to 18.75 times (P0.001) and 1.50 times (P0.05) to 1.50 fold (P0.05). In mouse melanocytes, the MITF protein of Oct-1 transfection group decreased significantly to 0.67 fold (P0.01) and increased to 1.16 fold (P0.05), the protein of TYRP-1 increased to 1.15 times (P0.05). [conclusion] Oct-1 was obtained by PCR, cloning and nucleic acid sequencing. The full length of the gene was 2 313 BP CDS region. By bioinformatics analysis, Oct-1 was found to be the dominant gene of coat color. After over-expression of Oct-1, the expression of MITF and TCF in melanocytes decreased, and the expression of ETB-R and CAM increased in 偽 MSHG / ACC-kit1ET1 and TYRP-1, respectively. Oct-1 can regulate the expression of major genes, regulate melanin synthesis and change the color of coat.
【作者單位】： 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院;山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;
【基金】：國家高科技研究發(fā)展計(jì)劃(“863”計(jì)劃,2013AA102506) 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303119) 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃(CXTD201201)
【分類號】：Q953

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本文編號：2092573