本文選題：先天性心臟病 + 易感性��； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的：文獻(xiàn)報(bào)道顯示干預(yù)小鼠體內(nèi)COL6A2基因的表達(dá)可致子代小鼠出現(xiàn)先天性房間隔缺損的病理表型,揭示COL6A2基因的表達(dá)水平變化與房間隔缺損的發(fā)病相關(guān),但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。非編碼RNA (microRNA, miRNA)是一類(lèi)序列較短,有著高度保守性的RNA,可通過(guò)與靶基因的3'-UTR (3'-Untranslated Region)區(qū)域特異結(jié)合,調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄活性。而靶基因3’-UTR區(qū)域單核苷酸多態(tài)性變異(single nucleotide polymorphism, SNP)可能影響miRNA與之結(jié)合,導(dǎo)致靶基因表達(dá)的變化。本實(shí)驗(yàn)旨在探討COL6A2基因上3'-UTR區(qū)域SNPs 是否影響 miRNA與之結(jié)合,從而在調(diào)節(jié)其在先天性房間隔缺損的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。方法：通過(guò)查詢(xún)Pubmed以及Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)搜索COL6A2基因3'-UTR區(qū)域中國(guó)漢族人群最小等位基因頻率大于0.05的SNP位點(diǎn),結(jié)合各SNP位點(diǎn)之間的連鎖不平衡反應(yīng),初步篩選擬研究位點(diǎn)。隨后在本研究小組前期先天性心臟病間隔缺損全基因組關(guān)聯(lián)研究數(shù)據(jù)庫(kù)(Genome Wide Association Studies)中查找上述位點(diǎn)的數(shù)據(jù)信息,選取在先天性房間隔缺損中關(guān)聯(lián)P值小于0.1的SNPs,再使用miRNA-SNP功能預(yù)測(cè)網(wǎng)站進(jìn)行功能預(yù)測(cè),選擇預(yù)測(cè)對(duì)結(jié)合能力有影響的SNPs作為功能研究位點(diǎn)。將構(gòu)建成功的不同miRNA的模擬物(mimic)及COL6A2基因3'-UTR序列不同SNP基因型的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞系、H9C2細(xì)胞系以及SD乳鼠原代細(xì)胞系進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。共分為四組：A.野生型質(zhì)粒+無(wú)miRNA mimic; B.野生型質(zhì)粒+miRNA mimic; C.突變型質(zhì)粒+無(wú)miRNA mimic; D.突變型質(zhì)粒+miRNA mimic。探討miRNA與COL6A2基因3’-UTR區(qū)域的結(jié)合反應(yīng),以及對(duì)COL6A2基因表達(dá)水平變化的影響。結(jié)果：通過(guò)查詢(xún)Pubmed以及Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù),COL6A2基因3'-UTR區(qū)域共搜索到5個(gè)中國(guó)漢族人群最小等位基因頻率大于0.05的SNP位點(diǎn),分別為rs559,rs1044598, rsl 1554666, rs7717和rs73382475。通過(guò)對(duì)先天性心臟病間隔缺損GWAS數(shù)據(jù)庫(kù)的查詢(xún),發(fā)現(xiàn)僅rs559和rs1044598位點(diǎn)的變異可能與先天性房間隔缺損發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,rs559不可調(diào)節(jié)miR-338-3p與COL6A2的結(jié)合,rs1044598可調(diào)節(jié)miR-4252與COL6A2的結(jié)合。以下為熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)P值：miR-4252與rs1044598質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組,D組與B組相比,HEK 293T(P=0.013), H9C2 (P=0.012),原代心肌細(xì)胞(P=0.009) 。 miR-338-3p與rs559質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組,A組與C組相比,HEK293T(P=0.158), H9C2 (P=0.342),原代心肌細(xì)胞(P=0.054)。結(jié)論：COL6A2基因3'-UTR區(qū)域rs1044598位點(diǎn)可能與先天性房間隔缺損的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),相對(duì)于攜帶野生TT基因型的人群,AA基因型顯著減少了36%的患病風(fēng)險(xiǎn)。miR-4252可以與COL6A2的3'-UTR區(qū)序列發(fā)生有效結(jié)合,與野生型TT基因型相比,變異型AA等位基因可使miR-4252結(jié)合更穩(wěn)定,并進(jìn)一步抑制COL6A2的轉(zhuǎn)錄活性,降低該基因表達(dá)水平,從而減少先天性房間隔缺損的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。而miR-338-3p與COL6A2的3'-UTR區(qū)序列不能發(fā)生有效結(jié)合,從而無(wú)法調(diào)控COL6A2的表達(dá)水平。
[Abstract]:Objective: it has been reported that the expression of COL6A2 gene in mice can induce the pathological phenotype of congenital atrial septal defect in offspring, and the expression level of COL6A2 gene is related to the pathogenesis of atrial septal defect. But the specific regulation mechanism is not clear. Non-coding RNA (miRNA) is a kind of short sequence, highly conserved RNAs, which can regulate the transcriptional activity of the gene by specifically binding with the target gene's 3na-UTR (3- untranslated region) region. The single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the target gene 3nc-UTR region may affect the binding of miRNAs and lead to the change of target gene expression. The aim of this study was to investigate whether SNPs in the 3H-UTR region of COL6A2 gene affect miRNA binding and thus play an important role in regulating the occurrence of congenital atrial septal defect. Methods: by querying Pubmed and Hapmap database, we searched for SNP loci in Chinese Han population with minimum alleles frequency greater than 0.05 in COL6A2 gene 3na-UTR region. Combined with linkage disequilibrium reaction among SNP loci, we preliminarily selected the sites to be studied. We then searched the Genome wide Association Studies database for these sites in our team's Genome wide Association Studies database for the early stage of congenital heart disease septal defect. SNPs with P value less than 0.1 in congenital atrial septal defect were selected, and then miRNA-SNP function prediction site was used to predict the function of SNPs. SNPs, which had influence on binding ability, were selected as functional research sites. The plasmids with different SNPs of (mimic) and COL6A2 gene were co-transfected into H9C2 cell line of HEK293T cell line and primary cell line of SD rat for luciferase reporter gene experiment. It was divided into four groups: A. Wild type plasmid without miRNA mimic. B. Wild type plasmid miRNA mimic; C. The mutant plasmid has no miRNA mimic.D. Mutant plasmid miRNA mimic. To study the binding reaction of miRNA with COL6A2 gene 3- UTR region and the effect of miRNA on the expression level of COL6A2 gene. Results: five SNPs with minimum alleles frequency greater than 0. 05 were found in Pubmed and Hapmap database. The minimum alleles were rs559, rs1044598, rsl 1554666, rs7717 and rs73382475, respectively. Only rs559 and rs1044598 loci were found to be associated with the risk of congenital atrial septal defect (CHD) by querying the Gwas database of congenital heart disease septal defect (CHD). The results of functional prediction showed that the combination of rs559 unadjustable miR-338-3p and COL6A2 could be adjusted by the combination of miR-4252 and COL6A2. The following is the experiment of luciferase reporter gene P value: miR-4252 and rs1044598 plasmid cotransfection group compared with group B: HEK293T (P0. 013), H9C2 (P0. 012), primary cardiomyocytes (P0. 009). MiR-338-3p co-transfected with rs559 plasmid group A compared with group C, HEK293T (P0. 158), H9C2 (P0. 342), primary cardiomyocytes (P0. 054). Conclusion the rs1044598 locus of the 3-UTR region of the 1: COL6A2 gene may be associated with the risk of congenital atrial septal defect. Compared with the population carrying the wild TT genotype, the AA genotype can significantly reduce the risk of the disease by 36%. MiR-4252 can be effectively combined with the 3- UTR region sequence of COL6A2. Compared with the wild-type TT genotype, the mutant AA allele could make miR-4252 binding more stable, further inhibit the transcription activity of COL6A2 and decrease the expression level of the gene, thus reducing the risk of congenital atrial septal defect. However, miR-338-3p could not combine with COL6A2 3-UTR region effectively, which could not regulate the expression level of COL6A2.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R541.1

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本文編號(hào)：2058904