本文選題：前強(qiáng)啡肽 + 強(qiáng)啡肽　； 參考：《醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)》2017年02期

【摘要】：目的強(qiáng)啡肽鎮(zhèn)痛效應(yīng)強(qiáng)、安全性好、無(wú)呼吸抑制和成癮性等優(yōu)勢(shì),是目前生物鎮(zhèn)痛研究的重點(diǎn)。探討慢病毒介導(dǎo)的大鼠前強(qiáng)啡肽(PDYN)基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)中的表達(dá),為后續(xù)研究大鼠癌痛模型的生物鎮(zhèn)痛提供條件。方法采用貼壁篩選法分離和擴(kuò)增BM-MSCs,流式細(xì)胞學(xué)和體外成脂、成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)鑒定。構(gòu)建大鼠PDYN慢病毒載體并感染BM-MSCs,倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)和Western blot法篩選最適感染復(fù)數(shù)(MOI);實(shí)驗(yàn)分為空白組(BM-MSCs)、實(shí)驗(yàn)組(PCDH-CMV-PDYN-EF1-cop GFP)、空載體組(PCDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP),采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)和Western blot檢測(cè)PDYN表達(dá)變化,采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)強(qiáng)啡肽蛋白表達(dá)。結(jié)果BM-MSCs呈長(zhǎng)梭形纖維細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng),多數(shù)表達(dá)CD29、CD44、CD90,少數(shù)表達(dá)CD45。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后油紅O染色為陽(yáng)性;成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié),經(jīng)茜素紅染色呈橘紅色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)示BM-MSCs細(xì)胞中CD29、CD90、CD44、CD45陽(yáng)性率分別為(99.80±0.19)%、(99.62±0.24)%、(96.86±1.27)%、(0.82±0.06)%,轉(zhuǎn)染PDYN基因后BM-MSCs表面標(biāo)記CD29、CD90、CD44、CD45陽(yáng)性率分別為(99.59±0.34)%、(98.06±1.51)%、(95.23±0.71)%、(10.23±0.59)%,轉(zhuǎn)染前后BM-MSCs干細(xì)胞特性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)PCR擴(kuò)增克隆測(cè)序鑒定慢病毒載體PCDH-CMV-PDYN-EF1-cop GFP構(gòu)建成功,重組慢病毒滴度為5×106IU/m L。綠色熒光蛋白的表達(dá)和Western blot結(jié)果示慢病毒MOI=100為最佳病毒感染復(fù)數(shù)。qPCR、Western blot檢測(cè)到經(jīng)慢病毒載體感染后的BM-MSCs中PDYN基因表達(dá)均上調(diào)(P0.05),免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)顯示強(qiáng)啡肽蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)。結(jié)論成功培養(yǎng)BM-MSCs和構(gòu)建大鼠PDYN基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體,在BM-MSCs中能高效穩(wěn)定表達(dá)PDYN基因和分泌強(qiáng)啡肽蛋白。
[Abstract]:Objective dynorphin has strong analgesic effect, good safety and no advantages of respiratory inhibition and addiction, so it is the focus of biological analgesia research. To investigate the expression of rat prodynorphin (PDYN) gene mediated by lentivirus in bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs), and to provide the conditions for further study on the biological analgesia of rat cancer pain model. Methods BM-MSCs were isolated and amplified by adherent screening, flow cytology and adipogenesis in vitro, and osteoblast induction and differentiation were identified. The rat PDYN lentivirus vector was constructed and infected with BM-MSCs, the expression of green fluorescent protein was observed under fluorescence microscope and the optimum number of infected moi was screened by Western blot method. The experiment was divided into blank group, experimental group, PCDH-CMV-PDYN-EF1-cop GFPV, empty vector group, PCDH-CMV-MCS-EF1-cop GFPA, and real-time fluorescence was used. The changes of PDYN expression were detected by light quantitative polymerase chain reaction (QPCR) and Western blot. The expression of dynorphin protein was detected by immunocytochemical staining. Results BM-MSCs grew like long fusiform fibroblasts, most of them expressed CD29, CD4 and CD90, and a few expressed CD45. Oil red O staining was positive after adipogenic culture, and mineralized nodules appeared after osteogenesis induction culture, which was orange by alizarin red staining. Flow cytometry showed that the positive rates of CD29, CD90, CD44, CD45 in BM-MSCs cells were 99.80 鹵0.19 and 99.62 鹵0.24, respectively. There was no significant difference in the characteristics of BM-MSCs stem cells before and after transfection of PDYN gene. The positive rates of CD2990, CD44 and CD45 were 99.59 鹵0.34, 98.06 鹵1.51 and 10.23 鹵0.59, respectively. There was no significant difference in the characteristics of BM-MSCs stem cells before and after transfection. The construction of lentivirus vector PCDH-CMV-PDYN-EF1-cop GFP was confirmed by PCR amplification cloning and sequencing. The recombinant lentivirus titer was 5 脳 106IU/m L. The expression of green fluorescent protein and Western blot showed that lentivirus MOI=100 was the best viral infection complex number. QPCRN Western blot detected that the expression of PDYN gene in BM-MSCs infected by lentivirus vector was up-regulated (P0.05), and immunocytochemical staining showed dynorphin eggs. White expression was significantly enhanced. Conclusion BM-MSCs and rat PDYN gene overexpression vector can express PDYN gene and secrete dynorphin protein efficiently and stably in BM-MSCs.
【作者單位】： 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院;廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)麻醉科;
【基金】：廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B021800206)
【分類(lèi)號(hào)】：R96

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【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

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9 張U，

本文編號(hào)：1967778