本文選題：CDK2 + 肝癌　； 參考：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究目的近年來(lái)隨著腫瘤發(fā)病率的逐年增加,惡性腫瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)生存的慢性病之一。腫瘤的治療方法主要有手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射治療、及腫瘤生物治療等。因近年來(lái)腫瘤患者對(duì)化學(xué)治療出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象逐年增加,使腫瘤患者對(duì)現(xiàn)有的化學(xué)藥物治療受到限制,開(kāi)發(fā)新的化學(xué)治療藥物迫在眉睫。細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)的激活與失活維持著細(xì)胞周期各時(shí)相有序進(jìn)行。CDK2磷酸化Rb是G1過(guò)渡到S期的關(guān)鍵步驟。抑制CDK2可以抑制腫瘤細(xì)胞的增生,為一個(gè)很好的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)。計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)是一門(mén)使用計(jì)算機(jī)模擬分子作用,通過(guò)綜合運(yùn)用生物信息學(xué)工具,從而達(dá)到選取、發(fā)現(xiàn)候選新藥目的。利用計(jì)算機(jī)蛋白-配體對(duì)接軟件(idock)可以預(yù)測(cè)一個(gè)小分子非共價(jià)地結(jié)合到靶蛋白時(shí),其最佳構(gòu)象和親和強(qiáng)度,通過(guò)其親和強(qiáng)度的打分高低可以篩選到目的蛋白抑制劑。本實(shí)驗(yàn)利用蛋白-配體對(duì)接軟件從FDA注冊(cè)過(guò)的藥物數(shù)據(jù)庫(kù)篩選靶蛋白CDK2候選抑制藥物,可以大大節(jié)省設(shè)計(jì)新藥物的成本和時(shí)間。篩選到的靶蛋白CDK2候選抑制藥物并被隨后的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證其生物有效性。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)大腸癌、肝癌細(xì)胞對(duì)篩選出來(lái)的CDK2候選抑制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室體內(nèi)、外驗(yàn)證其對(duì)大腸癌、肝癌的治療作用,尋找治療大腸癌、肝癌的新型CDK2抑制劑。研究方法：(1) Redocking驗(yàn)證idock軟件的準(zhǔn)確性、有效性。(2)利用蛋白-配體對(duì)接軟件(idock)找到CDK2靶蛋白的候選抑制劑。(3)通過(guò)MTT對(duì)初篩出來(lái)的候選藥物進(jìn)行腫瘤細(xì)胞抑制率的檢測(cè),從而找到目的藥物。(4)對(duì)目的藥物進(jìn)行細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯的作用。(5)通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)目的藥物進(jìn)行細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用。(6)通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的藥物對(duì)細(xì)胞周期信號(hào)通路的相關(guān)蛋白CDK2、cyclinD1、cyclinB1、cyclinE、Rb、pho-CDk2、pho-Rb的表達(dá)的影響。(7)檢測(cè)目的藥物對(duì)裸鼠移植瘤模型的治療作用,觀察其抗腫瘤效果。(8)蛋白-配體對(duì)接idock軟件結(jié)構(gòu)分析在分子水平說(shuō)明目的藥物抑制CDK2的作用機(jī)理。研究結(jié)果：(1) Redocking結(jié)果顯示idock軟件相對(duì)同類(lèi)的軟件的準(zhǔn)確性、有效性提高了7%,速度提高了8.69-37.51倍。(2)通過(guò)蛋白-配體對(duì)接軟件(idock)找到且購(gòu)買(mǎi)到CDK2靶蛋白的候選抑制劑9個(gè),并被隨后的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其生物有效性。(3)通過(guò)MTT對(duì)初篩出來(lái)的候選藥物進(jìn)行腫瘤細(xì)胞抑制率的檢測(cè),從而找到對(duì)大腸癌細(xì)胞系DLD1及LOVO呈現(xiàn)時(shí)間及濃度梯度依賴(lài)性抑制效果最好的藥物Adapalene (IC50:4.43μM for DLD1,7.135μM for LOVO)。同時(shí)找到對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2及Huh7呈現(xiàn)時(shí)間及濃度依賴(lài)性抑制效果最好的藥物Fluspirilene(IC50:4.017μM for HepG2 and 3.468μM for Huh7)。(4)用Adapalene對(duì)大腸癌細(xì)胞系DLD1及LOVO進(jìn)行細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示Adapalene 30/10μM濃度呈現(xiàn)時(shí)間及濃度梯度依賴(lài)性G1期細(xì)胞阻滯增高趨勢(shì)。Fluspirilene 30/10μM濃度對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2及Huh7呈現(xiàn)時(shí)間及濃度梯度依賴(lài)性G1期細(xì)胞阻滯增高趨勢(shì)。(5) Adapalene 30/10μM濃度對(duì)大腸癌細(xì)胞系DLD1及LOVO干擾后進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè),結(jié)果顯示呈現(xiàn)時(shí)間及濃度梯度依賴(lài)性凋亡細(xì)胞數(shù)增高趨勢(shì)。Fluspirilene 30/10μM濃度干擾肝癌細(xì)胞系HepG2及Huh7呈現(xiàn)時(shí)間及濃度梯度依賴(lài)性凋亡細(xì)胞數(shù)增高趨勢(shì)。(6)Adapalene藥物干擾大腸癌細(xì)胞系DLD1及LOVO后.Western Blot檢測(cè)CDK2、 cyclinE、Rb、pho-CDk2、pho-Rb蛋白隨著藥物的濃度增加而呈現(xiàn)表達(dá)下降的趨勢(shì),cyclinD1、cyclinB1蛋白的表達(dá)沒(méi)有改變。Fluspirilene干擾肝癌細(xì)胞系HepG2及Huh7后Western Blot檢測(cè)CDK2、cyclinE、Rb、pho-CDk2、pho-Rb蛋白隨著藥物的濃度增加而呈現(xiàn)表達(dá)下降的趨勢(shì),cyclinD1、cylinB1蛋白的表達(dá)沒(méi)有改變。(7) Adapalene對(duì)DLD1皮下成瘤BALB/C裸鼠移植瘤模型進(jìn)行藥物治療后,20mg/kg呈現(xiàn)明顯的抗腫瘤的效果。Fluspirilene對(duì)Huh7皮下成瘤BALB/C裸鼠移植瘤模型進(jìn)行藥物治療后,15mg/kg呈現(xiàn)明顯的抗腫瘤的效果。(8)利用分子對(duì)接及分子動(dòng)力研究表明Adapalene主要通過(guò)疏水鍵Phe82、Ile10、 Leu134、Lys33、His84與CDK2競(jìng)爭(zhēng)ATP口袋區(qū)結(jié)合位點(diǎn)；Fluspirilene主要通過(guò)疏水鍵Phe82、Ile10、Leu134、His84與CDK2競(jìng)爭(zhēng)ATP口袋區(qū)結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)利用了計(jì)算機(jī)蛋白-配體對(duì)接idock軟件篩查CDK2靶蛋白抑制劑候選藥物及進(jìn)一步體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證其生物有效性。我們找到了抗大扇癌的藥物Adapalene及抗肝癌藥物Fluspirilene。Adapalene通過(guò)疏水鍵Phe82、Ile10、 Leu134、Lys33、His84與CDK2競(jìng)爭(zhēng)ATP口袋區(qū)結(jié)合位點(diǎn),從而抑制了CDK2的活性；Fluspirilene通過(guò)疏水鍵Phe82、Ile10、Leu134、His84與CDK2競(jìng)爭(zhēng)ATP口袋區(qū)結(jié)合位點(diǎn),從而抑制了CDK2的活性。通過(guò)抑制CDK2/cyclinE及Rb細(xì)胞周期通路從而使細(xì)胞大量的阻滯在G1期,并進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,延緩腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。Adapalene及Fluspirilene表現(xiàn)出了良好口服活性劑和較低的毒性,可以成為潛在的抗大腸癌及肝癌的很好的CDK2抑制劑靶向藥物。
[Abstract]:A new type of CDK2 inhibitor for the treatment of colorectal cancer and liver cancer has been developed . ( 6 ) The effect of target drugs on the expression of CDK2 , cyclin D1 , cyclin B1 , cyclin E , Rb , bcl - CDk2 and Rb - Rb in the cell cycle signal pathway was investigated by Western Blot . The results showed that the expression of CDK2 , cyclin E , Rb , bcl - CDk2 , cyclin D1 and cyclin B1 in HCC cell line HepG2 and Huh7 showed no change . ( 7 ) The expression of cyclin D1 and cyclin B1 did not change .
In this experiment , we have found that the drug Adapalene and anti - hepatoma drugs Flussurlene . Adapalene have been used to screen CDK2 target protein inhibitor candidate drugs and further in vitro laboratory to verify its biological effectiveness .
By inhibiting CDK2 / cyclin E and Rb cell cycle pathways to block the cell apoptosis and delay the growth of tumor cells , Adapalene and Flussurlene showed good oral and low toxicity , which could be a good targeting drug for CDK2 inhibitors against colorectal cancer and liver cancer .
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R979.1

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5 陳s，

本文編號(hào)：1948298