本文選題：梅花 + 肌醇半乳糖苷合成酶　； 參考：《華中農業(yè)大學》2017年碩士論文

【摘要】：梅(Prunus mume Sieb.et Zucc.)原產我國南方地區(qū),冬季低溫限制了其在北方地區(qū)的分布。棉子糖家族寡糖(Raffinose family oligosaccharides,RFOs)在植物體內的積累能夠提高植物抵抗、適應逆境的能力,是植物細胞內重要的滲透調節(jié)物質,由蔗糖逐步疊加半乳糖基團合成。肌醇半乳糖苷合成酶(Galaetinol synthase,GolS)和棉子糖合成酶(Raffinose synthase,RS)是合成過程中的重要酶。為探索PmGolS和PmRS基因在響應非生物逆境脅迫中的功能,本研究從‘雪梅’中克隆得到了5個PmGolS基因(Pm003196、Pm006697、Pm008430、Pm012900、Pm020004)和2個PmRS基因(Pm027594、Pm025896),并構建了相應的超量表達載體;利用qRT-PCR檢測了它們在晝夜和非生物逆境脅迫下的表達模式;異源轉化擬南芥,鑒定轉化植株在非生物逆境脅迫下的抗性;同時,轉化梅花,獲得了正常生根的轉基因植株。主要結果如下:1.PmGolS和PmRS基因的克隆與序列分析根據‘雪梅’幼葉4℃低溫處理下的基因表達譜和梅花基因組數據,克隆了5個PmGolS基因和2個PmRS基因。進化樹分析發(fā)現:不同物種間GolS同源蛋白的近緣性高于同一物種內的不同GolS亞型,說明,物種進化可能發(fā)生在種內GolS基因序列復制事件之后;RS同源蛋白進化樹的分析結果與GolS一致。氨基酸序列分析發(fā)現:PmGol S編碼的蛋白質氨基酸序列高度保守,在第130個氨基酸左右都有錳結合元件DXD,在第270個氨基酸左右都有絲氨酸磷酸化位點,且羧基末端都有一個特征性的疏水性五肽(APSAA);而PmRS編碼的蛋白質氨基酸序列保守性較低,但都具有KXD和RXXXD兩個保守催化域。2.PmGolS和PmRS基因在晝夜及非生物逆境脅迫下的表達模式以‘雪梅’幼葉為材料,利用qRT-PCR技術,檢測了5個PmGolS基因和2個PmRS基因晝夜及低溫、干旱、高鹽和ABA脅迫下的表達豐度變化,結果表明:PmGolS基因中Pm003196存在明顯的晝夜表達規(guī)律,另外6個基因并無明顯的晝夜表達規(guī)律;所有目的基因都不響應ABA脅迫,但對另外三個非生物逆境脅迫各有不同程度的響應,Pm003196、Pm006697、Pm025896響應低溫脅迫,Pm008430、Pm027594、Pm025896響應NaCl脅迫,Pm003196、Pm008430、Pm025896、Pm027594響應甘露醇脅迫,Pm027594不響應低溫脅迫,Pm012900、Pm020004在所有脅迫下表達量都很低。3.PmGolS蛋白亞細胞定位構建了PmGolS家族中的三個基因Pm003196、Pm008430、Pm006697相應的YFP融合蛋白表達載體,對其進行亞細胞定位分析。結果顯示,三種蛋白均分布在細胞核、細胞質和細胞膜中。4.PmGolS和PmRS基因異源轉化擬南芥及轉化植株的抗寒性分析構建了5個PmGolS基因和2個PmRS基因的超量表達載體,并轉化擬南芥。T1代擬南芥陽性苗RT-PCR分析結果顯示,除Pm020004外,其它基因均獲得高表達轉化株系。對擬南芥T2代和野生型株系進行低溫處理和電導率測定,結果顯示:轉PmGolS基因擬南芥株系的存活率和相對電導率與野生型株系沒有明顯差別;而轉PmRS基因擬南芥株系的存活率比野生型株系高,且相對電導率比野生型株系低;此外,轉Pm003196基因擬南芥高株系的種子在400mM甘露醇脅迫下的萌發(fā)率比野生型高。5.PmGolS轉化梅花PmGolS基因超量表達載體轉化梅花成熟胚子葉,共侵染262個外植體,得到了轉Pm008430基因的抗性芽24個,轉入伸長培養(yǎng)基后有15個抗性芽伸長至23澴笥，

本文編號：1844002