發(fā)布時間：2018-05-02 13:31

  本文選題：淋病奈瑟菌 + CRISPR系統(tǒng)��； 參考：《揚州大學》2017年碩士論文

【摘要】：淋病是全球發(fā)病率最高的性傳播疾病之一,淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,Ng)是淋病的病原體。淋病奈瑟菌感染可導致不孕不育,還可促進人類免疫缺陷病毒(HIV)的傳播。隨著抗生素使用種類的更新,淋病奈瑟菌耐藥性范圍也不斷擴增,給淋病治療帶來極大難度。為此亟需全面了解淋病奈瑟菌的生物學特性,以利于從根本上控制淋病。近年發(fā)現(xiàn)約90%古細菌和40%真細菌基因組中存在CRISPR系統(tǒng),由CRISPR簇、前導序列(Leader)以及一系列CRISPR相關蛋白(Cas)基因構成,為細菌防御噬菌體和外源基因的侵襲發(fā)揮重要作用,是細菌的獲得性免疫系統(tǒng)。課題組前期分析淋病奈瑟菌WHO-A株基因組信息發(fā)現(xiàn)6個CRISPR簇和2個分別屬于CT1133家族和TM1801家族的Cas基因(下文分別稱CT和TM),本研究檢測了淋病奈瑟菌WHO-A株Cas基因的表達,并對其功能進行了初步探究。研究內容分為以下四個部分:一、淋病奈瑟菌Cas基因的類型分析與原核表達載體構建目前至少報道了 45個Cas基因家族,為了分析淋病奈瑟菌WHO-A株Cas基因的類型,對WHO-A株的兩個Cas基因進行BLAST分析,與已公布的相關基因進行同源性比較。為研究淋病奈瑟菌中CRISPR系統(tǒng)中Cas蛋白的結構和功能,根據(jù)前期WHO-A株基因組序列測定結果確定其Cas基因的具體位置并設計引物。為將CT或TM基因均分別插入pCold-TF和pGEX-6p-1中,上下游引物兩端分別添加有Pst Ⅰ和KpnⅠ以及Bam HⅠ和Xho Ⅰ酶切位點。提取淋病奈瑟菌WHO-A株總DNA為模板,PCR擴增Cas基因。擴增產(chǎn)物和載體使用相同雙酶切處理,酶切產(chǎn)物分別純化回收后用T4連接酶連接,構建Cas基因原核表達載體。二、重組Cas蛋白的原核表達和多克隆抗體制備將原核表達載體pCold-CT(TM)和pGEX-CT(TM)分別轉化至大腸埃希菌BL21(DE3),得到的重組菌用IPTG作可溶性表達的小量誘導,經(jīng)SDS-PAGE檢測到分子量與預期大小一致的表達產(chǎn)物后,用同樣方法進行大量誘導,取pCold-CT(TM)-BL21和pGEX-CT(TM)-BL21的上清分別通過鎳親和層析柱和谷胱甘肽樹脂柱,純化產(chǎn)物CT(TM)-His和CT(TM)-GST用SDS-PAGE作分子量分析,并用BCA試劑盒檢測目的蛋白的含量。用純化的CT(TM)-His融合蛋白免疫BALB/c小鼠,4w后收集血清,以CT(TM)-GST融合蛋白為抗原檢測免疫血清中特異性抗體的效價。結果表明,獲得了符合預期大小的CT和TM重組蛋白,間接ELISA檢測表明小鼠免疫血清中的CT和TM抗體的效價分別為1:25600和1:12800。制備的特異性抗體為檢測淋病奈瑟菌WHO-A株細胞內相應Cas蛋白的表達和研究蛋白功能提供了實驗材料。三、淋病奈瑟菌WHO-A株Cas基因的表達分析為檢測淋病奈瑟菌WHO-A株中Cas基因的轉錄和表達情況,我們用RT-PCR法、ELISA法和免疫熒光法3種方法分別檢測了細菌細胞內的Cas-mRNA和Cas蛋白。(1)提取該菌總RNA為模板,通過RT-PCR法轉錄獲得cDNA,用Cas基因引物對cDNA進行PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析;(2)對WHO-A株細菌作超聲裂解處理,取裂解液為抗原,以制備的Cas抗體為第一抗體,棋盤滴定法檢測裂解菌液中Cas蛋白的存在情況;(3)將WHO-A株細胞用4%多聚甲醛固定于載玻片上,以CT(TM)血清抗體作為一抗,以FITC標記的羊抗鼠IgG作為二抗進行免疫熒光實驗,熒光顯微鏡下檢測樣品的發(fā)光情況。結果表明,從WHO-A株總RNA中用RT-PCR可擴增出與CT或TM基因大小一致的DNA條帶;WHO-A株細菌超聲裂解液包被量為200 pg/ml時,以1:12800的CT多抗和1:800的TM多抗可以檢測到相應Cas蛋白表達的明顯信號;WHO-A株細菌細胞固定后用CT或TM抗體可檢測到特異性熒光。以上結果提示Cas基因在淋病奈瑟菌WHO-A株細胞中可進行有效轉錄與表達,淋病奈瑟菌的CRISPR系統(tǒng)可能是一個具有活性的完整系統(tǒng),為此需進一步研究Cas蛋白的結構與功能。四、淋病奈瑟菌WHO-A株Cas蛋白功能的初步研究實驗室前期已構建pCas9-KRn重組載體,即一種靶向卡那霉素抗性基因的CR]ISPR簡化系統(tǒng),可作為Cas蛋白核酸酶活性的研究工具。為探究CT或TM蛋白是否發(fā)揮核酸酶活性,將pCas9-KRn中的Cas9基因替換為CT或TM基因。以pCas9-KRn中Cas9以外的部分為模板設計引物并進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物兩端分別添加了PstⅠ、Kpn Ⅰ酶切位點,雙酶切并純化后與相同酶切處理的CT或TM基因連接,獲得重組質粒pCT(TM)-KRn,轉化宿主大腸埃希菌后分別用RT-PCR和ELISA兩種方法檢測到WHO-Cas基因的表達。pCT(TM)-KRn轉化至含pET-30a的DH5α大腸埃希菌,用LB培養(yǎng)液對重組菌進行傳代。每代菌液分別在卡那霉素和氯霉素LB平板上的活菌計數(shù)結果表明,二者的CFU值沒有明顯差異,提示未發(fā)現(xiàn)WHO-Cas蛋白的核酸酶活性,其作用機制可能與Cas9蛋白的核酸酶活性具有較大差別。
[Abstract]:In recent years , we have found that there are six CRISPR clusters and two genes of CRISPR . In recent years , we have found that there are 6 CRISPR clusters and two genes of CRISPR . The recombinant plasmid pCas9 - KRn was amplified by RT - PCR . The results showed that the recombinant plasmid pCas9 - KRn was used as the first antibody , and then the recombinant plasmid pCT ( TM ) - KRn was used as the first antibody . The recombinant plasmid pCT ( TM ) - KRn was transformed into DH5.alpha . E . coli containing pET - 30a .

【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R378

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本文編號：1834143