本文選題：水稻黑條矮縮病 + 抗性基因��； 參考：《南京農(nóng)業(yè)大學》2016年碩士論文

【摘要】：水稻黑條矮縮病病原為水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV),由灰飛虱(Laodelphax striatellus)以持久、非經(jīng)卵方式傳播,是當前稻麥輪作區(qū)乃至全國稻區(qū)最為嚴重的病毒病害。RBSDV不僅侵染水稻,還可侵染玉米和小麥,分別引起水稻黑條矮縮病、玉米粗縮病和小麥綠矮病,受害植株均表現(xiàn)矮縮、葉色濃綠、結(jié)實率低等癥狀。培育抗性品種是控制水稻黑條矮縮病最為經(jīng)濟有效的手段,但RBSDV抗性基因的分離鑒定研究進展緩慢,為此,本研究以抗性品種烏殼構(gòu)建的F2群體為對象、SLAF-seq(specific length amplified fragment sequencing)技術(shù)構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜,結(jié)合人工接種鑒定方法評價抗性表型,精細定位了 RBSDV抗性QTL(quantitative trait locus),在此基礎上,對其中3個抗黑條矮縮病QTL(qRBSDV-6d、qRBSDV-6e、qRBSDV-6f)進行候選基因的篩查和轉(zhuǎn)基因鑒定,期望分離出抗性基因位點,主要研究結(jié)果如下:1.借助水稻全基因組測序Gramene數(shù)據(jù)庫、生物信息學和高通量測序報告(http://www.gramene.org/;http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/;http://www.uniprot.org/),對 3 個抗性QTLs區(qū)段存在的295個候選基因進行基因注釋和電子篩查,重點篩選R基因和防衛(wèi)相關(guān)的抗病基因。最終,共篩查出27個R基因和29個防衛(wèi)相關(guān)基因。其中,R基因中有3個NBS-LRR、18個類受體蛋白激酶(LRR-RLK、lectin-RLK、PR-RLK、RLK)、2個蛋白激酶(STK、CDPK)、1個脯氨酸富集蛋白、1個轉(zhuǎn)錄因子和2個翻譯起始因子(eIF2)等;在防衛(wèi)相關(guān)基因中,11個參與防衛(wèi)反應信號轉(zhuǎn)導,調(diào)節(jié)防衛(wèi)基因表達(MAPK激酶、蛋白質(zhì)磷酸化酶、鋅指蛋白、磷脂酰肌醇、鈣調(diào)蛋白),6個參與結(jié)構(gòu)抗病(POD),5個參與蛋白質(zhì)的降解(E3泛素蛋白連接酶)和4個抗病蛋白類似物等。2.設計引物,通過PCR從抗病親本烏殼和感病親本淮稻5號中擴增候選基因,共克隆出41個候選基因,包括20個R基因和21個抗病相關(guān)基因。測序結(jié)果表明,在抗病品種烏殼和感病品種淮稻5號中存在氨基酸差異的候選基因有23個。InterPro數(shù)據(jù)庫和SMART網(wǎng)站,分析氨基酸差異對結(jié)構(gòu)或功能域的影響,發(fā)現(xiàn)10個候選基因的氨基酸差異發(fā)生在結(jié)構(gòu)和功能域中,或改變結(jié)構(gòu)域種類。同時,為進一步驗證這些候選基因氨基酸差異的穩(wěn)定性,在后代F2代極抗和極感單株中進行克隆測序,發(fā)現(xiàn)其在F2代抗感群體中發(fā)生了遺傳交換,仍然存在穩(wěn)定的氨基酸差異。3.基于雙重驗證和功能預測的結(jié)果,本研究最終選擇了 5個候選基因,分別為:編碼LRR-RLK的R06和R08、編碼STK的R22、編碼U-box E3泛素連接酶的P01、編碼PHD鋅指蛋白的P02,插入經(jīng)改造的以玉米泛素Ubi為啟動子,以潮霉素基因為選擇標記的植物雙元表達載體pCAMBIA1301,構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體,經(jīng)農(nóng)桿菌介導的方法將目的基因轉(zhuǎn)化至感病親本淮稻5號,生成轉(zhuǎn)基因植株。對得到的轉(zhuǎn)基因株系R08、P01、R22、R06和P02進行陽性植株的檢測,通過PCR的方法先進行潮霉素基因檢測,后通過分子測序檢測目的基因,最終分別得到22、8、24、28和38個轉(zhuǎn)基因陽性植株,為以后的深入研究奠定了材料基礎。同時,為了明確分離出的RBSDV抗性基因?qū)τ衩状挚s病可能的抗性,本研究在接種中引入灰飛虱有效接種量的概念,優(yōu)化和完善了玉米粗縮病人工接種鑒定的最適條件,為后續(xù)抗性基因的功能分析提供方法上的保證。
[Abstract]:The results were as follows : 1 . Three NBS - LRR , 18 receptor protein kinases ( LRR - RLK , lectin - RLK , PR - RLK , RLK ) , two protein kinases ( STK , CDPK ) , 1 proline - enriched protein , 1 transcription factor and 2 translation initiation factors ( eIF2 ) were selected . Based on the results of double validation and functional prediction , we found that there were 23 candidate genes , including 20 R genes and 21 disease resistance genes .

【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S435.111

【參考文獻】

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