本文選題：腸桿菌科細菌 + CTX-M-55�。� 參考：《鄭州大學》2017年碩士論文

【摘要】：背景與目的由于新型廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物和第三代頭孢菌素在臨床上的廣泛使用,造成CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended spectrum beta-lactamases ESBLs)檢出率呈逐年上升趨勢,且在全球范圍內(nèi)傳播快速,分布廣泛。自1986年首次檢出CTX-M酶以來,在社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染中,CTX-M已成為最為流行的ESBL型別之一,現(xiàn)已在大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、變形桿菌等至少26種細菌中發(fā)現(xiàn)了CTX-M酶。CTX-M-55酶屬于CTX-M-1組,自2004年首次在泰國發(fā)現(xiàn)產(chǎn)CTX-M-55型ESBLs的大腸埃希菌至今,已在韓國、中國、印度、日本、美國、英國、俄羅斯等數(shù)十個國家快速流行傳播,宿主菌包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、黏質(zhì)沙雷桿菌、沙門菌屬、志賀菌屬等十余種病原菌。除人類外,感染宿主還涉及家禽、牲畜、水源、蔬菜、野生動植物等,覆蓋人類生存生活的各個領域,對公共衛(wèi)生產(chǎn)生嚴重威脅。因此,對CTX-M-55型ESBLs的傳播機制的研究有助于遏制其傳播,控制其轉(zhuǎn)移,臨床意義與社會價值重大。bla_(CTX-M)耐藥基因多數(shù)存在于質(zhì)粒,部分可定位于染色體上。耐藥基因是否定位于染色體,與菌株的型別有關系。定位于染色上的bla_(CTX-M)耐藥基因具有遺傳穩(wěn)定性。質(zhì)粒是導致bla_(CTX-M)耐藥基因水平傳播轉(zhuǎn)移的重要因素之一。接合型質(zhì)粒能通過接合傳遞在同種或不同種屬的細菌之間進行穿梭,導致更多種類細菌的耐藥,甚至在局部造成耐藥細菌的大規(guī)模爆發(fā)和流行。bla_(CTX-M)耐藥基因的基因環(huán)境,及其周圍基因元件對耐藥基因的表達,轉(zhuǎn)移和傳播都有著極為重要的調(diào)控作用。如:位于bla_(CTX-M)基因的上游的插入序列ISEcpI可使多種bla_(CTX-M)耐藥基因高水平表達并能夠攜帶耐藥基因在染色體與質(zhì)粒之間進行轉(zhuǎn)移,在不同菌種之間進行傳播擴散。插入序列IS26、IS903和ORF477也經(jīng)常與bla_(CTX-M)耐藥基因相關。這些可移動元件可隨機分布在bla_(CTX-M)耐藥基因上下游,并在不同的bla_(CTX-M)耐藥基因中組成不同形式的基因組件,共同或單獨作用于耐藥基因,對其表達進行調(diào)控,其傳播進行介導。CTX-M型ESBLs快速傳播的機制十分復雜。我們前期在臨床1株肺炎克雷伯桿菌中首次檢出bla_(CTX-M-55)型ESBLs,進一步研究顯示CTX-M-55是CTX-M耐藥性進程中重要一環(huán),但是對于本地區(qū)CTX-M-55是否具有特殊的轉(zhuǎn)移播散能力?是否具有獨特的上下游基因結(jié)構?國內(nèi)外流行菌株間是否有相關性尚不清楚。本研究擬通過基因定位、高通量測序準確分析明確基因環(huán)境;通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合實驗探究其傳播機制從而為臨床延緩或控制細菌耐藥性的升級提供有價值的線索。方法1.菌株收集收集2015年07月至2015年12月半年內(nèi),鄭州大學第一附屬醫(yī)院細菌室分離的耐三代、四代頭孢類抗菌藥物的革蘭陰性桿菌共357株,所有菌株均采用VitekⅡCompact鑒定至種。2.藥物敏感試驗和ESBLs表型確證實驗利用MIC法進行藥敏試驗,參照2014年CLSI標準進行藥敏結(jié)果判讀。根據(jù)2014年CLSI推薦的ESBLs篩選標準進行初步篩選并進一步采用酶抑制劑增強試驗進行確證。3.bla_(CTX-M-55)耐藥基因篩選及定位分析采用PCR技術對目的基因進行擴增,擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,挑取陽性片段進行測序分析,初步篩選bla_(CTX-M-55)耐藥基因陽性菌株。分別提取bla_(CTX-M-55)耐藥基因初篩陽性菌株的染色體和質(zhì)粒DNA,采用PCR擴增bla_(CTX-M-55),再進行瓊脂糖凝膠電泳和測序,確定bla_(CTX-M-55)耐藥基因在細菌中的位置。4.傳播轉(zhuǎn)移機制分析對定位于質(zhì)粒上的陽性菌株進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合試驗。通過以上試驗分析bla_(CTX-M-55)耐藥基因的傳播轉(zhuǎn)移機制。5.耐藥菌株的同源性分析采用多位點序列分型(MLST)對bla_(CTX-M-55)耐藥基因陽性的菌株進行同源性分析結(jié)果1.bla_(CTX-M-55)耐藥基因的檢出結(jié)果357株ESBLs陽性菌株中共13株病原菌攜帶bla_(CTX-M-55),且均為腸桿菌科細菌,其中包括大腸埃希菌7株,肺炎克雷伯桿菌3株,弗氏檸檬酸桿菌1株,黏質(zhì)沙雷桿菌1株和摩根摩根菌1株。非發(fā)酵菌中未有bla_(CTX-M-55)耐藥基因陽性菌株檢出。2.基因定位與質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合實驗結(jié)果基因定位分析結(jié)果顯示所有菌株的bla_(CTX-M-55)耐藥基因均被質(zhì)粒所攜帶且質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合實驗接合率為100%。3.基因環(huán)境檢測結(jié)果經(jīng)檢測,bla_(CTX-M-55)耐藥基因與其上下游基因元件共形成四種不同模式的基因組件。在13株bla_(CTX-M-55)耐藥基因上游均發(fā)現(xiàn)ISEcp1的存在,其中兩株被IS26插入截斷,一株被IS1294插入;在12株bla_(CTX-M-55)耐藥基因下游發(fā)現(xiàn)ORF477,另外1株下游為IS903。ISEcp1?-bla_(CTX-M-55)-?IS903基因組件是一種新型組合形式,在bla_(CTX-M-55)首次檢出。10株含有Int1類整合子,1株為Int2類整合子,2株未檢出整合子類型。13株bla_(CTX-M-55)耐藥基因陽性菌株中有5株同時攜帶blaTEM,兩株同時攜帶blaTEM和blaSHV。4.MLST分型情況對bla_(CTX-M-55)耐藥基因陽性的7株大腸埃希菌和3株肺炎克雷伯桿菌進行MLST分型,共檢測出9種ST型別,其中兩株來自不同科室(消化內(nèi)科和ICU)的大腸埃希菌的ST型別一致(ST305),其與菌株的ST均不相同[ST305,ST182,ST381,ST446 and ST2(大腸埃希菌)and ST148,ST269 and ST37(肺炎克雷伯桿菌)]。結(jié)論1.CTX-M-55型ESBLs在本地區(qū)已然形成多菌種擴散蔓延趨勢,尤以腸桿菌科細菌為甚,需引起臨床的高度警惕,嚴防出現(xiàn)院內(nèi)感染的爆發(fā)流行。2.可接合型質(zhì)粒、ISEcp1等bla_(CTX-M-55)基因周圍可移動元件是其在細菌間傳播轉(zhuǎn)移的主要因素。臨床應增強bla_(CTX-M-55)基因攜帶菌監(jiān)測與防控工作,避免耐藥基因的局部爆發(fā)流行。
[Abstract]:CTX - M - 55 enzyme belongs to CTX - M - 1 group . CTX - M - 55 enzyme is one of the most popular ESBL types . CTX - M - 55 enzyme is one of the most popular ESBL types . This study was carried out by means of PCR to determine the position of the drug - resistant gene of CTX - M - 55 . The results showed that CTX - M - 55 was a key link in the drug resistance . and the local outbreak of the drug resistant gene is avoided .

【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R446.5

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