本文選題：盾殼霉 + 核盤菌��； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：盾殼霉(Coniothyrium minitans)作為菌核病的重要生防菌,其產(chǎn)孢和寄生能力備受研究者關(guān)注。先前實(shí)驗(yàn)室為了在分子水平上研究其分生孢子產(chǎn)生及重寄生機(jī)制,構(gòu)建了野生型菌株ZS-1的T-DNA插入突變體庫(kù)。本文以插入體庫(kù)中3株產(chǎn)孢異常的轉(zhuǎn)化子ZS-1N22225,ZS-1TN1961和ZS-1TN5012為材料進(jìn)行研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:菌株ZS-1N22225的菌落顏色較淺,生長(zhǎng)慢,產(chǎn)孢量少,為T-DNA單拷貝插入突變體。通過(guò)反向PCR克隆到了Vam6/Vps39的同源基因CmVps39,CmVps39序列全長(zhǎng)具有3315 bp,包括一個(gè)3216 bp的開放閱讀框及兩個(gè)內(nèi)含子,推定編碼1071 aa的蛋白質(zhì)。T-DNA插入在該基因的啟動(dòng)子區(qū)域,使得ZS-1N22225中該基因的表達(dá)量降低。CmVps39蛋白在N端和C端分別含有一個(gè)非常保守的CNH和CLN結(jié)構(gòu)域,與其它真菌中Vps39具有高度同源性。通過(guò)基因敲除與互補(bǔ)技術(shù)研究CmVps39的功能,表明CmVps39敲除轉(zhuǎn)化子ΔCmVps39與T-DNA突變體ZS-1N22225的生物學(xué)性狀一致,其生長(zhǎng)速度、分生孢子的產(chǎn)生量以及寄生核盤菌菌核的能力都明顯降低,而互補(bǔ)菌株的生物學(xué)性狀都得到了恢復(fù),這表明CmVps39在盾殼霉的菌絲生長(zhǎng)、分生孢子的產(chǎn)生及重寄生過(guò)程中都具有十分重要的作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),CmVps39定位于液泡,ΔCmVps39突變體的液泡不能融合成核心大液泡,而表現(xiàn)為眾多小囊泡無(wú)規(guī)律的分布。同時(shí),發(fā)現(xiàn)基因CmVps39不僅能調(diào)控液泡的形態(tài),也具有維持滲透和pH平衡的作用。此外,研究發(fā)現(xiàn)基因CmVps39還參與到細(xì)胞自噬過(guò)程,該基因的缺失導(dǎo)致細(xì)胞自噬的程度減弱,從而影響了盾殼霉的產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)和重寄生能力。菌株ZS-1TN1961生長(zhǎng)正常,菌落顏色偏白,是T-DNA單拷貝插入的突變體。采用hiTAIL-PCR技術(shù)克隆到了T-DNA插入位點(diǎn)的左側(cè)序列,對(duì)其進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)T-DNA破壞了一個(gè)可能的基因,該序列具有1327 bp,包括一個(gè)1131 bp的開放閱讀框以及三個(gè)內(nèi)含子,推定編碼一個(gè)376 aa的假定蛋白,此假定蛋白包含一個(gè)非常保守的Aim24結(jié)構(gòu)域,因此命名此基因?yàn)镃mAim24。T-DNA插入在基因CmAim24的編碼區(qū)域,距離起始密碼子(ATG)46 nt。進(jìn)一步通過(guò)基因敲除和互補(bǔ)技術(shù)對(duì)該基因的功能進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)該基因在盾殼霉分生孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)以及寄生核盤菌菌核方面起著重要作用。此外,通過(guò)亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)該基因定位于線粒體,敲除該基因?qū)е戮�粒體畸形、腫大、結(jié)構(gòu)松散。同時(shí),細(xì)胞內(nèi)活性氧含量上升,ΔCmAim24在非發(fā)酵性碳源上的生長(zhǎng)受到更大程度的抑制。菌株ZS-1TN5012是一株菌落顏色較淺、生長(zhǎng)慢、分生孢子產(chǎn)生有缺陷的突變體。Southern blot證明ZS-1TN5012為T-DNA單拷貝插入突變體,通過(guò)hiTAIL-PCR技術(shù)克隆了突變菌株ZS-1TN5012中T-DNA所在位點(diǎn)左側(cè)的核苷酸序列。序列分析表明T-DNA插入破壞了一個(gè)全長(zhǎng)為1170 bp的基因,該基因不包含內(nèi)含子,推定編碼389 aa的蛋白質(zhì)。將推定氨基酸序列進(jìn)行同源性比較,發(fā)現(xiàn)該序列與其它物種的3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)具有高度同源性,因此將該基因命名為CmHmgr。HMGR為甲羥戊酸生成通路的限速酶,他汀類藥物可以抑制其活性發(fā)揮。通過(guò)培養(yǎng)基中添加阿托伐他汀發(fā)現(xiàn),ZS-1也表現(xiàn)出突變體ZS-1TN5012一致的表型。此外,突變體ZS-1TN5012對(duì)該藥物的敏感性增加。通過(guò)亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),該基因定位在盾殼霉的線粒體,進(jìn)一步通過(guò)基因敲除和互補(bǔ)技術(shù)表明,該基因影響盾殼霉孢子的形成及重寄生作用。綜上,本研究從盾殼霉中克隆到三個(gè)產(chǎn)孢相關(guān)基因CmVps39、CmAim24和CmHmgr。研究發(fā)現(xiàn),這三個(gè)基因都影響了盾殼霉分生孢子的產(chǎn)生和重寄生能力,說(shuō)明盾殼霉分子孢子形成和寄生過(guò)程十分復(fù)雜,受到多種基因的調(diào)控。
[Abstract]:The results showed that CmVps39 could not only regulate vacuolar morphology but also maintain osmotic and pH balance . The results showed that CmVps39 could not only regulate vacuolar morphology but also maintain osmotic and pH balance . This gene was identified as CmHmgr.HMGR is a restriction enzyme which has a full length of 1170 bp . The gene does not contain intron , and it is a putative protein encoding 389 aa . The gene is cloned into three sporulation - related genes CmVps39 , CmAim24 and CmHgr.Through the addition of atorvastatin , the gene is cloned into three sporulation - related genes CmVps39 , CmAim24 and CmHgr.Through the subcell localization , the gene is cloned into three sporulation - related genes CmVps39 , CmAim24 and CmHgr.After the gene knockout and complementary techniques , the gene is cloned into three sporulation - related genes CmVps39 , CmAim24 and CmHgr.These three genes are very complex to the formation and parasitism of the conidium of the pelarmold .

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S476

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1757149