本文關(guān)鍵詞：TSA促進(jìn)轉(zhuǎn)基因豬體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育和外源基因表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

HEREDITAS (Beijing) 2011年7月, 33(7): 749―756 ISSN 0253-9772

研究報(bào)告

DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00749

TSA促進(jìn)轉(zhuǎn)基因豬體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育和外源基因表達(dá)

孔慶然, 朱江, 黃波, 郇延軍, 王峰, 石永乾, 劉仲鳳, 武美玲, 劉忠華

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150030

摘要: 不完全的表觀遺傳重編程是造成轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物效率低下的主要原因, 組蛋白修飾作為表觀遺傳修飾

的一個(gè)重要部分, 可以直接影響克隆胚胎的發(fā)育和外源基因的表達(dá)情況。TSA(Trichostatin A)作為一種組蛋白去乙�；种苿�, 可以改變組蛋白的乙酰化水平, 促進(jìn)表觀遺傳重編程, 提高克隆動(dòng)物的效率。同時(shí)TSA能改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu), 使轉(zhuǎn)錄因子易于與DNA序列結(jié)合, 促進(jìn)外源基因的表達(dá)。文章確定了TSA處理轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞和核移植胚胎的最佳條件, 分別為250 nmol/L、24 h和40 nmol/L、24 h, 通過(guò)進(jìn)一步正交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), TSA同時(shí)處理供體細(xì)胞和克隆胚胎可以顯著的促進(jìn)核移植胚胎的體外發(fā)育。此外, 無(wú)論TSA處理轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞或核移植胚胎, 都可以提高外源基因的表達(dá)水平。

關(guān)鍵詞: TSA; 體細(xì)胞核移植; 胚胎發(fā)育; 外源基因表達(dá); 豬

TSA improve transgenic porcine cloned embryo development and transgene expression

KONG Qing-Ran, ZHU Jiang, HUANG Bo, HUAN Yan-Jun, WANG Feng, SHI Yong-Qian, LIU Zhong-Feng, WU Mei-Ling, LIU Zhong-Hua

College of Life Science, Northeast Agricultural University of China, Harbin 150030, China

Abstract: Uncompleted epigenetic reprogramming is attributed to the low efficiency of producing transgenic cloned animals. Histone modification associated with epigenetics can directly influence the embryo development and transgene expression. Trichostatin A (TSA), as an inhibitor of histone deacetylase, can change the status of histone acetylation, im-prove somatic cell reprogramming, and enhance cloning efficiency. TSA prevents the chromatin structure from being con-densed, so that transcription factor could binds to DNA sequence easily and enhance transgene expression. Our study estab-lished the optimal TSA treatment on porcine donor cells and cloned embryos, 250 nmol/L, 24 h and 40 nmol/L, 24 h, re-spectively. Furthermore, we found that both the cloned embryo and the donor cell treated by TSA resulted in the highest development efficiency. Meanwhile, TSA can improve transgene expression in donor cell and cloned embryo. In summary, TSA can significantly improve porcine reconstructed embryo development and transgene expression.

Keywords: TSA; somatic cell nuclear transfer; embryo development; transgene expression; pig

收稿日期: 2010?10?15; 修回日期: 2010?12?21

基金項(xiàng)目:轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專(zhuān)項(xiàng)(編號(hào)：2008ZX08006-002, 2009ZX08006-001B)和東北農(nóng)業(yè)大學(xué)“創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助

作者簡(jiǎn)介:孔慶然, 博士, 講師, 研究方向：胚胎工程與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。Tel: 0451-55191747; E-mail: kqr1982@yahoo.com.cn

朱江, 碩士, 研究方向：胚胎工程。Tel: 0451-55191747; E-mail: zhujiang1021@yahoo.cn

孔慶然和朱江同為第一作者。

通訊作者:劉忠華, 博士, 教授, 研究方向：胚胎工程與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。E-mail: liu086@yahoo.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2011-5-23 16:48:25

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750 HEREDITAS (Beijing) 2011 第33卷

轉(zhuǎn)基因技術(shù)經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展, 已成為當(dāng)今生物技術(shù)研究的熱點(diǎn)。近10多年來(lái), 與核移植技術(shù)的結(jié)合, 轉(zhuǎn)基因效率大大提高, 攜帶有不同外源基因的不同種類(lèi)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物迅速增加[1]。近年來(lái), 體細(xì)胞克隆豬、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆豬相繼誕生[2~5], 這些突破極大的促進(jìn)了基礎(chǔ)研究的發(fā)展, 推動(dòng)了生物醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)生產(chǎn)的進(jìn)步[6]。

雖然我們已經(jīng)能夠得到體細(xì)胞克隆豬, 但是克隆豬的效率依然較低。造成克隆豬效率低下的一個(gè)重要原因是不徹底的表觀遺傳重編程[7]。研究表明, 體細(xì)胞不徹底的表觀遺傳重編程, 會(huì)嚴(yán)重影響核移植胚胎的發(fā)育[8], 卵母細(xì)胞胞質(zhì)對(duì)體細(xì)胞核徹底的重編程, 是決定核移植胚胎發(fā)育, 產(chǎn)生克隆動(dòng)物的一個(gè)重要條件[9]。組蛋白乙酰化作為表觀遺傳修飾的一個(gè)重要部分, 在核移植胚胎發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用[10]。組蛋白乙酰化可以使染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)松散, 促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合, 進(jìn)而促進(jìn)相關(guān)發(fā)育基因的正常表達(dá)。研究表明, H3K9的乙酰化與染色質(zhì)的活性構(gòu)象相關(guān)[11], H4K16的乙�；瘎t直接影響染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的包裝[12]。

曲古抑菌素A(Trichostatin A, TSA)是一種去乙�；敢种苿�, 其通過(guò)抑制去乙酰化酶的活性來(lái)提高組蛋白的乙�；潭取SA處理供體細(xì)胞和克隆胚胎, 可以促進(jìn)胚胎發(fā)育相關(guān)基因Oct4、Sox2、FGF4、c-Myc、Klf4、Enomes和 Cdx2的表達(dá)[13], 從而顯著促進(jìn)小鼠、牛等動(dòng)物克隆胚胎的發(fā)育[14,15]。在豬上, 已有實(shí)驗(yàn)表明用TSA處理核移植胚胎可以顯著提高其體外發(fā)育率

[16]

與克隆豬的

出生率[17]。但是用TSA處理后, 出生克隆豬的死 亡率較高[16], 這使得我們擔(dān)心TSA對(duì)胚胎是否有負(fù)面作用。因此我們需要進(jìn)一步探索TSA處理供體細(xì)胞和核移植胚胎的最適濃度和時(shí)間, 得到最佳的處理方式。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中, 普遍存在著外源基因沉默的現(xiàn)象, 外源基因的沉默與表觀遺傳修飾密切相 關(guān)[18], TSA作為組蛋白乙�；揎椀恼{(diào)節(jié)藥物, 能否促進(jìn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚中外源基因的表 達(dá), 至今尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。探索TSA對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及其核移植胚胎中外源基因表達(dá)的影響, 可使我們進(jìn)一步了解外源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá)情況及其 調(diào)節(jié)機(jī)制, 為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培育奠定理論與技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

胎兒成纖維細(xì)胞取自妊娠32 d長(zhǎng)白豬胎兒, eGFP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞取自體細(xì)胞核移植技術(shù)產(chǎn)生的eGFP轉(zhuǎn)基因克隆豬; 豬卵巢取自哈爾濱呼蘭屠宰場(chǎng)。 1.2 方法

1.2.1 成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

在豬場(chǎng)采集妊娠母豬的子宮或成豬耳部組織,

置于37℃添加雙抗的生理鹽水中, 迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。從豬子宮中取出胎兒, 用PBS清洗干凈, 去除四肢、頭部, 眼科剪充分剪碎; 耳部組織用PBS清洗干凈后直接剪碎。加入3 mL 1 mg/mL膠原酶, 置于37.5℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化2~3 h。消化后2 000 r/min離心10 min, 去上清液, 用4 mL培養(yǎng)液(高糖DMEM+ 10% FBS)重懸, 1 000 r/min離心5 min, 去上清, 再用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞/細(xì)胞團(tuán)塊液, 取2~3 mL移入φ=7 cm培養(yǎng)皿中并加入4 mL培養(yǎng)液, 置于38.5℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁50%~60%時(shí), 半量更換培養(yǎng)液, 以后每2 d全量換液一次, 并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況; 待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿底80%~90%時(shí), 吸去培養(yǎng)液, 用DPBS清洗2~3次, 加入0.5 mL 0.25%胰酶消化2~4 min, 用等量細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化, 輕輕吹打成單細(xì)胞懸液, 1 000 r/min離心5 min, 細(xì)胞培養(yǎng)液將所得細(xì)胞沉淀制成懸液, 以1~2×106個(gè)/mL細(xì)胞濃度接種在9 cm培養(yǎng)皿中, 置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每2 d全量換液一次。3~5代后可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 核移植胚胎的構(gòu)建

1.2.2.1 卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng) 將屠宰場(chǎng)收集的卵巢置于37℃添加雙抗的生理鹽水中, 運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室。用注射器抽取卵巢表面直徑為3~6 cm的卵泡, 收集含有卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的液體, 用TL-HEPES洗2次后, 在顯微鏡下挑選具有3層以上卵丘細(xì)胞的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)液為改進(jìn)的TCM199加10% 卵泡液, 培養(yǎng)條件為39℃、5% CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱。成熟培養(yǎng)42 h后, 用0.1%的透明質(zhì)酸酶消化卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體, 去除卵丘細(xì)胞, 在顯微鏡下挑選帶有極體的卵母細(xì)胞,

第7期

孔慶然等: TSA促進(jìn)轉(zhuǎn)基因豬體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育和外源基因表達(dá) 751

作為成熟卵母細(xì)胞, 用于核移植實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 體細(xì)胞核移植 將成熟的卵母細(xì)胞置于7.5 mg/mL細(xì)胞松弛素B的操作液中, 采用盲吸法, 在顯微鏡下吸出第一極體及其周?chē)牟糠职|(zhì), 以吸出1/4左右的胞質(zhì)認(rèn)為完全去核。選取外表光滑、發(fā)亮的細(xì)胞, 注入透明帶和質(zhì)膜之間, 使供核細(xì)胞與質(zhì)膜緊密接觸。

1.2.2.3 融合與激活 采用電擊的方法, 一步實(shí)現(xiàn)融合與激活。將胚胎置于融合液中, 使兩細(xì)胞的接觸面與兩電極的連線垂直, 1.2 kv/cm、30 μs直流電電擊2次。在豬胚胎培養(yǎng)液靜置30 min后, 選取融合的胚胎, 進(jìn)行胚胎培養(yǎng)。

1.2.2.4 核移植胚胎的體外培養(yǎng) 融合的胚胎置于PZM-3培養(yǎng)液中培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為39℃、5% CO2、飽和濕度。培養(yǎng)至36 h檢測(cè)卵裂率, 156 h檢測(cè)囊胚率及囊胚細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 成纖維細(xì)胞與核移植胚胎的藥物處理

在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加相應(yīng)質(zhì)量的TSA, 使其到達(dá)指定的濃度, 用此培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞, 達(dá)到處理時(shí)間后, 更換正常的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

在PZM-3中添加相應(yīng)質(zhì)量的TSA, 使其到達(dá)指定的濃度, 將重構(gòu)胚置此培養(yǎng)液中, 達(dá)到處理時(shí)間后, 清洗, 再移入正常的PZM-3中培養(yǎng)。 1.2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察與活率分析

收集各不同處理?xiàng)l件下的成纖維細(xì)胞, 在光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài), 采用Computer-assisted cell analysis system (CASY) I cell-analyzing unit (Sch?rfe Systems, Reutlingen, Germany)細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞活率。 1.2.5 流式細(xì)胞儀分析

將GFP轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞用胰酶消化, PBS清洗后懸浮, 進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。細(xì)胞檢測(cè)時(shí), 激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為488 nm, 接受波長(zhǎng)設(shè)為525 nm, 并通過(guò)對(duì)野生型豬成纖維細(xì)胞(對(duì)照)的檢測(cè), 確定測(cè)量點(diǎn)(排除陰性細(xì)胞的自發(fā)熒光)、檢測(cè)門(mén)(排除細(xì)胞碎片和死細(xì)胞)和檢測(cè)速度(保證細(xì)胞的生物活性)。 1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR分析

提取核移植胚胎的總RNA(RNeasy Mini Kit,

Qiagen), 將提取的RNA反轉(zhuǎn)為cDNA (PrimeScriptTM RT Reagent Kit, TaKaRa), 然后用Real-time PCR檢測(cè)GFP基因的表達(dá)情況(SYBR Premix Ex TaqTM , TaKaRa)。GFP的上游引物為5'-TGAACCGCATCGA GCTGAAGGG-3', 下游引物為5'-ACCTTGATGCC GTTCTTCTGCTTG-3', 18S rRNA作為內(nèi)參, 其上游引物為5'-TCCAATGGATCCTCGCGGAA-3', 下游引物為5'-GGCTACCACATCCAAGGAAG-3'。 1.2.7 熒光分析

收集不同時(shí)期的GFP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞核移植胚胎, 使用蛋白酶K去掉透明帶, 固定、透膜后, 用10 mg/L Hoechst 33342染色, 壓片后于熒光鏡(Nikon 70i)下觀察細(xì)胞核及GFP的分布與表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 TSA 處理對(duì)豬胎兒成纖維的影響

用0 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L的TSA分別處理第3代胎兒成纖維細(xì)胞12 h、24 h、48 h、72 h、96 h, 取樣檢測(cè)細(xì)胞活率。結(jié)果如圖1所示。隨著TSA處理濃度的增大和處理時(shí)間的增長(zhǎng), 細(xì)胞活率都會(huì)出現(xiàn)顯著的下降。0.25 μmol/L TSA處理細(xì)胞24 h, 細(xì)胞活率不會(huì)出現(xiàn)顯著下降, 與對(duì)照組基本保持一致。

對(duì)不同濃度和時(shí)間TSA處理的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察, 結(jié)果如圖2所示。0.25 μmol/L TSA處理成纖維細(xì)胞24 h后, 細(xì)胞形態(tài)與正常細(xì)胞相同, 沒(méi)有出現(xiàn)異常形態(tài)的細(xì)胞, 但是隨著處理濃度的增加和處理時(shí)間的增長(zhǎng), 細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)變長(zhǎng)、膨脹和貼壁力下降等現(xiàn)象。

2.2 TSA 處理對(duì)轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞中外源基因

表達(dá)的影響

TSA 處理對(duì)轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞中外源基因表達(dá)的影響如圖3所示。與對(duì)照組相比, 0.25 μmol/L TSA處理GFP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞24 h后, GFP表達(dá)明顯增強(qiáng), GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也顯著增加。為了更精確的確定GFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例, 用流式細(xì)胞儀對(duì)處理和未處理組進(jìn)行了檢測(cè), 結(jié)果如圖4所示, 經(jīng)TSA處理后, GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較未處理組增加近一倍。

752 HEREDITAS (Beijing) 2011

第33卷

圖1 TSA對(duì)豬成纖維細(xì)胞活率的影響

A: 不同處理濃度和處理時(shí)間的TSA對(duì)豬成纖維細(xì)胞活率的影響; B: CASY I細(xì)胞活率分析儀檢測(cè)圖例。

圖2 TSA對(duì)豬成纖維細(xì)胞形態(tài)的影響(×400)

A: 0 μmol/L (對(duì)照)TSA處理對(duì)豬成纖維細(xì)胞形態(tài)的影響; B: 0.25 μmol/L 24h TSA處理對(duì)豬成纖維細(xì)胞形態(tài)的影響; C: 0.5 μmol/L 12h TSA處理對(duì)豬成纖維細(xì)胞形態(tài)的影響; 箭頭所指為形態(tài)異常的細(xì)胞。

2.3 不同濃度TSA處理對(duì)克隆胚胎體外發(fā)育的影響

采用豬胎兒成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞, 在核移

表1所示。隨著處理濃度的升高, 卵裂率并沒(méi)有顯著的變化; 囊胚率則隨著處理濃度的升高, 呈現(xiàn)出

, 最適的處理濃度為40 nmol/L, 植胚胎激活后, 分別用0 nmol/L、20 nmol/L、 先升高后降低的趨勢(shì)

此時(shí)的囊胚率顯著高于其他處理組和對(duì)照組40 nmol/L、60 nmol/L、80 nmol/L的TSA處理24 h, 檢測(cè)胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚細(xì)胞數(shù), 結(jié)果如

(P<0.05), 囊胚細(xì)胞數(shù)也顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

  本文關(guān)鍵詞：TSA促進(jìn)轉(zhuǎn)基因豬體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育和外源基因表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。