本文選題：丁香假單胞菌 + 效應蛋白��； 參考：《合肥工業(yè)大學》2017年碩士論文

【摘要】：病原微生物對自身生命活動的調(diào)控、進化集中體現(xiàn)在與宿主的相互作用、攻防博弈中。丁香假單胞菌番茄致病變種Pseudomonas syringae pv.tomato(Pst)是引起細菌性斑點病影響番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的病原微生物。P.syringae pv.tomato與其宿主植物番茄之間的相互作用也是研究病原微生物-植物相互作用的一個重要模式。Pto是植物識別、防御丁香假單胞菌的抗性蛋白。Pto可以識別結(jié)合病原菌注入植物細胞的效應蛋白AvrPtoB、AvrPto,并由此觸發(fā)下游防御反應,最終在侵染部位產(chǎn)生超敏反應誘導組織壞死,防止病原菌的定殖和繁殖。因此,Pto成為病原微生物-植物相互作用的一個樞紐蛋白,但Pto介導的免疫途徑的框架仍未完整闡明。本文通過克隆番茄Pti(Pto interaction protein)基因Pti4、Pti5和Pti6,分別構建植物瞬時表達載體,利用農(nóng)桿菌介導方法在煙草葉片中進行表達,并進一步利用免疫共沉淀技術,在植物體系中檢測它們與番茄Pto、病原菌效應蛋白AvrPtoB的相互作用。同時,通過Pti4、Pti5和Pti6基因載體構建、番茄遺傳轉(zhuǎn)化,獲得過量表達轉(zhuǎn)基因植株。通過病原菌Pst DC3000接種,檢測Pti基因在番茄防御丁香假單胞菌侵襲中的作用。實驗結(jié)果表明,利用所構建Pti4、Pti5和Pti6基因植物表達載體,在煙草中獲得了預期大小Pti4、Pti5和Pti6蛋白,并在植物體系中驗證了它們與Pto蛋白,及其活性突變體Pto~(Y207D)的相互作用,表明Pti蛋白參與Pto介導的植物免疫應答途徑,但它們相互作用強弱的差異,則提示Pti4、Pti5和Pti6蛋白可能在具體功能作用中有所不同。通過免疫共沉淀進一步分析發(fā)現(xiàn),Pti4、Pti5和Pti6蛋白與病原菌效應蛋白AvrPtoB有相互作用。AvrPtoB與Pti蛋白的互作是否使其成為病原菌毒性效應蛋白的靶標,還是促進Pto蛋白對AvrPtoB的識別,仍需進一步實驗探討。此外,通過農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化,獲得了Pti4、Pti5基因過量表達轉(zhuǎn)基因番茄植株。利用真空滲透法接種病原菌Pst DC3000后,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植株葉片、莖稈病斑,葉片菌落計數(shù)均明顯減少,表明Pti4和Pti5基因可提高番茄對P.syringae pv.tomato的抗性。本工作為進一步探討與Pto互作的這些Pti轉(zhuǎn)錄因子的功能、深入了解它們在病原微生物-植物相互作用關系中的角色,以及應用于植物抗病遺傳改良都提供了良好基礎。
[Abstract]:The regulation of pathogenic microorganisms on their own life activities is mainly reflected in the interaction with the host and the game of attack and defense.The interaction between P. syringae pv.tomato and its host plant tomato, Pseudomonas syringae pv.tomatoPstis, which causes bacterial spot disease, affects the yield and quality of tomato, is also a study of pathogenetic microorganism and plant interaction.An important pattern of action. Pto is plant recognition,The resistance protein. Pto of Pseudomonas clove can recognize the effector protein AvrPtoBn, which is injected into plant cells by pathogenic bacteria, and trigger the downstream defense reaction, and finally produce hypersensitive reaction to induce tissue necrosis at the site of infection.To prevent colonization and reproduction of pathogenic bacteria.Therefore, Pto is a pivotal protein in the pathogenetic microorganism-plant interaction, but the framework of the immune pathway mediated by Pto has not been fully elucidated.In this paper, plant transient expression vectors were constructed by cloning tomato Pti(Pto interaction protein gene Pti4, Pti5 and Pti6, respectively. Agrobacterium tumefaciens mediated expression was used in tobacco leaves, and immunoprecipitation technique was further used.Their interaction with tomato, pathogen effector protein (AvrPtoB) was detected in plant system.At the same time, transgenic plants were obtained from transgenic tomato by construction of Pti4 Pti5 and Pti6 gene vectors.The role of Pti gene in tomato defense against Pseudomonas cloves was detected by inoculation of pathogen Pst DC3000.The results showed that the plant expression vectors of Pti4, Pti5 and Pti6 genes were used to obtain the expected size of Pti4Pti5 and Pti6 proteins in tobacco, and their interaction with Pto protein and its active mutant Ptochy207D was verified in plant system.The results indicated that Pti protein was involved in the Pto mediated plant immune response pathway, but the differences of their interactions suggested that Pti4Pti5 and Pti6 proteins might be different in specific function.By immunoprecipitation, it was found that the interaction between Pti4Pti5 and Pti6 protein and pathogenic effector protein (AvrPtoB). The interaction of AvrPtoB and Pti protein made it a target of virulence effector protein of pathogenic bacteria, or promoted the recognition of AvrPtoB by Pto protein.Further experiments are needed.In addition, transgenic tomato plants were obtained by Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation.Compared with wild-type transgenic plants inoculated with Pst DC3000 by vacuum osmotic method, the number of leaf, stem spot and colony of transgenic plants decreased significantly, indicating that Pti4 and Pti5 genes could increase the resistance of tomato to P.syringae pv.tomato.This work provides a good basis for further exploring the functions of these Pti transcription factors interacting with Pto, understanding their roles in the relationship between pathogenic microorganisms and plants, and applying them to genetic improvement of plant disease resistance.
【學位授予單位】：合肥工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S436.412

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本文編號：1745339