本文選題：CRISPR-Cas系統(tǒng) + CYP105　； 參考：《安徽大學》2017年博士論文

【摘要】：維吉尼亞鏈霉菌IBL14(Streptomycesvirginiae IBL14)是一株從甾體藥物制藥廠排污池土壤中分離得到的放線菌。該菌株能在多種留醇類化合物(包括薯蕷皂素、雌二醇、去氧皮質(zhì)酮、膽固醇、麥角固醇等)為唯一碳源的培養(yǎng)基上進行生長,并且能通過次級代謝產(chǎn)生多種新的甾醇類化合物。為系統(tǒng)闡明該菌株CPY在復雜的次級代謝過程中的功能與機理,實驗室已對S.virginiaeIBL14進行了全基因組測序,并利用G0、KEGG和Swiss-Prot,以及NR和COG等數(shù)據(jù)庫對獲得的全基因組數(shù)據(jù)進行了基因分析與功能注釋。本論文旨在對該染色體中的CYP105家族基因進行信息學分析預測、基因敲除、蛋白表達、生物轉(zhuǎn)化及結(jié)構(gòu)與功能分析。S.virginniae IBL14全基因組的生物信息學分析發(fā)現(xiàn):該菌株含有31個CYP450 基因,其中:svh001、svu001、svu003、svu004、sVu005 為 CYP105 家族基因,svh001、svu003、svu004具有極高的同源性,其二級結(jié)構(gòu)基本相同,推測三個基因在結(jié)構(gòu)和功能上是極其保守的,可能具有類似的功能。sVu005基因和svh001、svu003、sVu004具有一定的二級結(jié)構(gòu)差異。svu001其氨基酸和其它CYP105同源性較低,但在二維結(jié)構(gòu)上,和其他CYP105家族基因沒有明顯區(qū)別,均含有13個α超螺旋結(jié)構(gòu);svu001和其它CYP105家族基因二維結(jié)構(gòu)主要的區(qū)別在于其α螺旋均比同家族基因長,導致其蛋白總長高達499個AA(一般為400個左右)。在CYP105家族基因的五個基因中,均發(fā)現(xiàn)了 K-helix和Heme binding motif 保守基序。svh001、svu003、svu004、svu005 的 Heme binding motif 極為保守,尤其是svu003、svu004的Heme binding motif完全一致;但與svu001的Heme binding motif有極大的差異。這五個基因的K-helix基序基本一致。而所有CYP家族中被認為是一個保守的I-helix基序,卻未在svu001發(fā)現(xiàn)。通過基因注釋、序列比對和系統(tǒng)進化樹的分析,我們確定svh001、svu003、svu004為CYP105C1;svu005為CYP105D1;svu00l因具有不同尋常的特征,認為其為CYP105家族中的一個新的亞家族或者是一個新的家族基因。全基因組的生物信息學分析還發(fā)現(xiàn):S.virginiae IBL14基因組存在著一個CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)。對該系統(tǒng)Cas蛋白的組成及排列結(jié)構(gòu)分析,我們將其命名其為Ⅰ-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)。實驗證明該系統(tǒng)能高效的對自身基因組中的基因進行編輯;特別是應用該系統(tǒng)開發(fā)的基因編輯工具可對其它生物進行有效的基因編輯,具有替代目前商用的Cas9基因編輯系統(tǒng)的潛力。實驗中,我們設計并構(gòu)建了包含編輯模板片段(templet DNA/t-DNA)和靶向基因片段(guide DNA/g-DNA)的基因編輯質(zhì)粒(gene editing plasmid),并將其轉(zhuǎn)化到S.virginiae IBL14原生質(zhì)體中,篩選得到上述5個CYP105家族基因敲除的轉(zhuǎn)化子。結(jié)合唯一碳源生長、生理形態(tài)分析、生物信息學分析等方法研究了CYP105家族基因?qū).virginiae IBL14生理功能的影響,結(jié)果表明:1)Ⅰ-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)可以成功對該基因組內(nèi)源基因進行編輯,其操作簡單、耗時短、效率高;2)CYP105家族基因的單敲除不致死,但會明顯影響菌體的生長和生理變化,其中IBL14Asvu004在液體和固體培養(yǎng)時大量產(chǎn)生胞內(nèi)色素,并且在液體培養(yǎng)時不形成菌絲球;3)S.virginiea IBL14復雜的次級代謝產(chǎn)物可以有效地抑制細菌和真菌的生長;4)CYP105基因的敲除通過影響聚酮的代謝途徑顯著影響IBL14的抗生素和抗真菌素的生產(chǎn)。實驗將CYP105家族基因在大腸桿菌中成功地進行了克隆,優(yōu)化了發(fā)酵條件,實現(xiàn)了可溶性的外源表達。并以多種留醇類化合物作為底物,進行了生物轉(zhuǎn)化功能分析。試驗表明:(1)svh001具有多種甾醇類物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化功能:輕化雌二醇生成雌三醇,輕化維生素D3生成25-羥基-維生素D3,輕化16,17環(huán)氧黃體酮生成新的輕化產(chǎn)物。(2)svu001可以輕化雌二醇生成雌三醇,輕化維生素D3生成25-輕基維生素D3,其所在基因簇與精氨酸代謝途徑相關,可以羥化精氨酸為N-ω-羥基-精氨酸。(3)svu003可以輕化雌二醇生成雌三醇,輕化維生素D3生成25-羥基-維生素D3。(4)svu004可以輕化雌二醇生成雌三醇和2要基雌二醇,輕化維生素D3生成25.輕基.維生素D3,羥化16,17環(huán)氧黃體酮生成新的輕化產(chǎn)物(不同于svh001)。(5)svu005可以輕化雌二醇生成雌三醇,輕化雄烯二酮生成9位輕基化產(chǎn)物,以及將二苯甲酮輕化為4-羥基二苯甲酮。(6)CYP105家族的三個C家族基因的表達蛋白在多種底物代謝中表現(xiàn)出一定的共性,但D家族的svu005基因表達蛋白具有相對獨立的底物域。本研究揭示維吉尼亞鏈霉菌IBL14的CYP105基因的亞家族定位與進化關系,探索了 CYP105家族基因的底物域,加深了羥化反應的分子機理的理解。本研究的結(jié)果有助于改造、合成新的輕化酶,提高酶的反應活力與環(huán)境適應能力;在甾醇類物質(zhì)的特定位點、特定立體構(gòu)象引入輕基,生產(chǎn)全新的甾體藥物及藥物中間體;促進對甾體污染物的轉(zhuǎn)化與降解。
[Abstract]:In order to clarify the function and mechanism of the CYP105 family gene in the complex secondary metabolic process , it is found that the two - dimensional structure of the CYP105 family gene is very conservative and has a similar function . The two - dimensional structure of svu001 , svu001 , svu003 , svu004 , svu003 and svu004 has a very high homology . In this paper , we identified svh001 , svu003 , svu004 as CYP105C1 , svu005 as a new subfamily of CYP105 family or a new family gene . ( 4 ) The gene cluster of CYP105 family has been successfully cloned in E . coli .

【學位授予單位】：安徽大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q93;Q78

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