本文選題：馬爾堡病毒　切入點(diǎn)：糖蛋白受體結(jié)合域　出處：《中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)》2017年07期

【摘要】：原核表達(dá)并純化馬爾堡病毒(Marburg virus,MARV)糖蛋白(glycoprotein,GP)受體結(jié)合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,并以此為抗原免疫家兔制備抗MARV-GP-RBD多克隆抗體。參照GenBank提供的MARV GP全基因序列,找到主要抗原表位區(qū)域,設(shè)計(jì)特異性引物,采用PCR方法擴(kuò)增RBD基因,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切(EcoRⅠ/XhoⅠ)后定向克隆至原核表達(dá)載體pET-30a(+),構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-GP-RBD,轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)表達(dá)宿主菌,在不同條件下(時(shí)間、IPTG濃度、溫度)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白,并用His-Band N+柱進(jìn)行親和層析純化;以純化的重組pET-30a(+)-GP-RBD蛋白免疫家兔,制備多克隆抗體。通過SDS-PAGE、Western blot和IFA鑒定重組蛋白的反應(yīng)原性及免疫原性。結(jié)果顯示:PCR擴(kuò)增到長(zhǎng)度為453bp的RBD基因片段;構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-30a(+)-GP-RBD經(jīng)雙酶切后得到與目的片段長(zhǎng)度相同的特異性條帶,測(cè)序結(jié)果顯示沒有突變;轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在培養(yǎng)7h、終濃度為0.4mmol/L IPTG和37℃條件下能夠充分誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),得到相對(duì)分子質(zhì)量為25 000的重組蛋白,主要以包涵體形式存在,BCA試劑盒產(chǎn)量測(cè)定,每升誘導(dǎo)的重組菌可純化約20mg純度較高的目的蛋白;Western blot檢測(cè)證實(shí)重組pET-30a(+)-GP-RBD蛋白能同時(shí)被抗His標(biāo)簽的單抗和兔源多抗識(shí)別并發(fā)生特異性反應(yīng),證明重組蛋白有良好的反應(yīng)原性;IFA鑒定證實(shí)所制備的兔源多抗能夠特異性識(shí)別表達(dá)MARV GP蛋白的重組桿狀病毒rBacmid-GP-VP40,證明重組蛋白具有良好的免疫原性。結(jié)果表明:成功表達(dá)、純化了MARV GP RBD蛋白,并完成了兔源多抗的制備,為MARV亞單位疫苗的制備和抗原、抗體檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:The recombinant plasmid pET - 30a ( + ) - GP - RBD was cloned into the prokaryotic expression vector pET - 30a ( + ) . The recombinant plasmid pET - 30a ( + ) - GP - RBD was cloned into the prokaryotic expression vector pET - 30a ( + ) . The recombinant plasmid pET - 30a ( + ) - GP - RBD was cloned into the prokaryotic expression vector pET - 30a ( + ) . The preparation of rabbit polyclonal antibody is completed , which lays a foundation for the preparation of MARV subunit vaccine and the establishment of antigen and antibody detection method .

【作者單位】： 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院;軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所/吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院;東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院;
【基金】：國(guó)家科技重大專項(xiàng)(重大新藥創(chuàng)制)資助項(xiàng)目(2015ZX09102025)
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1718028