本文選題：日本血吸蟲　切入點(diǎn)：SjTNFR　出處：《上海師范大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：血吸蟲病是一種全球分布、影響較為嚴(yán)重的重要人獸共患病。目前可用治療藥物存在潛在抗性,同時缺乏有效的疫苗,使得新藥的開發(fā)顯得尤為重要。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種主要方式。日本血吸蟲細(xì)胞凋亡的深入研究可為篩選日本血吸蟲新藥靶提供新思路。本實(shí)驗(yàn)通過對日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因SjTNFR的克隆、原核和真核表達(dá)、及該基因生物學(xué)功能的初步探討,為深入闡述日本血吸蟲的凋亡機(jī)制積累了知識,為評估SjTNFR作為血吸蟲病治療藥物靶標(biāo)的潛力提供了基礎(chǔ)。1.日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因SjTNFR的克隆表達(dá)及生物學(xué)特性分析利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了日本血吸蟲SjTNFR的全長序列,構(gòu)建了重組質(zhì)粒。序列分析表明該基因ORF含603bp,編碼200個氨基酸,理論分子量為22.3Da,理論等電點(diǎn)為7.6。生物信息學(xué)分析表明該基因不含有信號肽以及跨膜區(qū)序列。結(jié)構(gòu)域分析表明該基因編碼蛋白屬于TNFR超家族成員。構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-SjTNFR,并在大腸桿菌中成功表達(dá)。Real-time PCR結(jié)果顯示該基因在大、小鼠來源14d、23d、32d、和42d四個不同發(fā)育階段蟲體均有表達(dá),其中大鼠來源蟲體SjTNFR的表達(dá)水平在14d后都明顯高于小鼠來源蟲體,在感染后32d和42d表達(dá)差異更明顯(P0.05)。提示該基因的差異表達(dá)可能是影響血吸蟲在大、小鼠不同適宜性宿主體內(nèi)生長發(fā)育的因素之一。2.SjTNFR的真核表達(dá)及功能初步分析通過PCR技術(shù)擴(kuò)增到SjTNFR功能區(qū)片段,成功構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pxj-40-SjTNFR,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞。細(xì)胞間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)染pxj-40-SjTNFR質(zhì)粒的293T細(xì)胞表達(dá)SjTNFR蛋白。Western blotting分析結(jié)果進(jìn)一步證明了重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中成功表達(dá),SjTNFR重組蛋白分子量大小約為26 kDa。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞早期凋亡比例為25.3%,而對照組為2.73%,轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞晚期凋亡比例為11.2%,對照組為2.73%。轉(zhuǎn)染組的早期凋亡和晚期凋亡比例均明顯高于對照組。綜合分析表明日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因SjTNFR具有一定的促凋亡作用。本文為深入開展SjTNFR的生物學(xué)功能分析,及篩選針對SjTNFR的藥物靶標(biāo)提供了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Schistosomiasis is a global distribution, which has a serious impact on zoonosis.The potential resistance of available therapeutic drugs and the lack of effective vaccines make the development of new drugs particularly important.Apoptosis is a major way of programmed cell death.Further study on apoptosis of Schistosoma japonicum cells may provide a new idea for screening new drug targets of Schistosoma japonicum.Through the cloning, prokaryotic and eukaryotic expression of the apoptosis-related gene SjTNFR of Schistosoma japonicum, and a preliminary study of the biological function of the gene, we have accumulated knowledge for the further elaboration of the apoptotic mechanism of Schistosoma japonicum.This provides a basis for assessing the potential of SjTNFR as a therapeutic target for schistosomiasis.Cloning, expression and Biological characteristics of SjTNFR, a apoptosis related Gene of Schistosoma japonicum, the full-length SjTNFR sequence of Schistosoma japonicum was amplified by PCR, and the recombinant plasmid was constructed.Sequence analysis showed that the gene ORF contains 603bpand encodes 200 amino acids with a theoretical molecular weight of 22.3 Daa and a theoretical isoelectric point of 7.6.Bioinformatics analysis showed that the gene did not contain signal peptide and transmembrane region sequence.Domain analysis showed that the gene encoded protein belonged to TNFR superfamily.The recombinant expression plasmid pET28a-SjTNFR was constructed, and the expression of .Real-time PCR in E. coli showed that the gene was expressed in four different developmental stages, E. coli.The expression level of SjTNFR in the rat body was significantly higher than that in the mouse after 14 days, and the difference was more obvious at 32 days and 42 days after infection.These results suggest that the differential expression of this gene may be one of the factors affecting the growth and development of Schistosoma japonicum in different suitable hosts. 2. The eukaryotic expression and function of SjTNFR were amplified into the functional region of SjTNFR by PCR technique.The eukaryotic recombinant expression plasmid pxj-40-SjTNFR was successfully constructed, and the recombinant plasmid was transfected into 293T cells by liposome transfection.Cell indirect immunofluorescence assay showed that 293T cells transfected with pxj-40-SjTNFR plasmid expressed SjTNFR protein. Western blotting analysis further demonstrated that the molecular weight of recombinant SjTNFR protein expressed in 293T cells was about 26kDa.The results of flow cytometry showed that the proportion of early apoptosis was 25.3in the transfected cells with recombinant plasmids, 2.73in the control group, 11.2in the transfection group and 2.73in the control group.The proportion of early and late apoptosis in transfection group was significantly higher than that in control group.Comprehensive analysis showed that the apoptosis-related gene SjTNFR of Schistosoma japonicum could promote apoptosis to some extent.This paper provides a basis for further analysis of biological function of SjTNFR and screening of drug targets for SjTNFR.
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.735

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本文編號：1710673