本文選題：Fat-基因　切入點：真核表達載體　出處：《生物工程學報》2016年02期

【摘要】：為了建立無篩選標記基因的轉Fat-1基因綿羊細胞系,本研究將PCR克隆得到的Fat-1基因,合成的attB、Loxp序列并克隆入pN1-EGFP框架載體,得到可刪除篩選標記基因的pEGFP-N1-Fat-1真核表達載體。體外轉錄合成phiC31整合酶mRNA并與線性化的pEGFP-N1-Fat-1載體共轉染綿羊胎兒皮膚成纖維細胞,G418篩選得到表達綠色熒光的單克隆,再利用pET-28a-His-NLS-TAT-Cre質粒誘導Cre重組蛋白表達,將純化后的Cre穿膜肽轉導表達綠色熒光的單克隆細胞,將熒光淬滅的細胞系擴繁,提取基因組DNA,進行PCR及測序鑒定,得到無標記轉Fat-1基因綿羊胎兒皮膚成纖維細胞系,為生產無篩選標記基因的轉基因綿羊奠定基礎。
[Abstract]:In order to establish a sheep cell line with Fat-1 gene without screening marker gene, the Fat-1 gene cloned from PCR was synthesized and cloned into pN1-EGFP frame vector to obtain the pEGFP-N1-Fat-1 eukaryotic expression vector which could delete the screening marker gene.In vitro transcription synthesis of phiC31 integrase mRNA and co-transfection with linearized pEGFP-N1-Fat-1 vector into sheep fetal skin fibroblast cell line G418 were used to screen the expression of green fluorescent monoclonal, and then pET-28a-His-NLS-TAT-Cre plasmid was used to induce the expression of Cre recombinant protein.The purified Cre transduction peptide was transduced into monoclonal cells expressing green fluorescence. The fluorescent quenched cell line was expanded, genomic DNA was extracted and identified by PCR and sequencing. The unlabeled fetal fibroblast cell line of sheep fetal skin with Fat-1 gene was obtained.To lay a foundation for the production of transgenic sheep without screening marker genes.
【作者單位】： 內蒙古農業(yè)大學生命科學學院內蒙古自治區(qū)生物制造重點實驗室;
【基金】：內蒙古生物高科技項目(No.20030301)資助~~
【分類號】：Q78

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本文編號：1707189