發(fā)布時(shí)間：2018-03-28 22:23

  本文選題：Dnmt　切入點(diǎn)：基因編輯　出處：《中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)》2016年07期

【摘要】：CRISPR/Cas9的發(fā)現(xiàn)為多種生物的基因編輯提供了強(qiáng)有力的工具。然而,該系統(tǒng)在提供靶向性基因修飾的同時(shí),會(huì)產(chǎn)生一些不需要的突變,即脫靶現(xiàn)象。為提高CRISPR/Cas9的特異性,我們將野生型Fok I核酸內(nèi)切酶的功能結(jié)構(gòu)域與催化功能區(qū)失活的Cas9蛋白(dCas9)進(jìn)行融合,形成融合蛋白用于降低脫靶效應(yīng)。FokⅠ是一種依賴于二聚化才能行使內(nèi)切酶活性的核酸酶,在本研究中,通過將FokⅠ功能結(jié)構(gòu)融合到dCas9的N端,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒p ST1374-dCas9-FokⅠ。我們前期研究中,發(fā)現(xiàn)一個(gè)sgRNA在介導(dǎo)Cas9編輯Dnmt1基因建立條件敲除大鼠時(shí),存在顯著的脫靶現(xiàn)象。以此為基礎(chǔ),我們利用dCas9-FokⅠ/sgRNA系統(tǒng)編輯大鼠Dnmt1基因,研究該系統(tǒng)是否能夠進(jìn)行基因編輯以及是否能夠提高基因編輯特異性。將轉(zhuǎn)錄好的dCas9-FokⅠmRNA和sgRNA顯微注射到SD大鼠的受精卵中,用于產(chǎn)生基因編輯大鼠。通過顯微注射以及胚胎移植,最終獲得43只F0代大鼠,其中兩只在靶點(diǎn)位置包含突變,突變效率達(dá)4.5%。對(duì)脫靶情況進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,無脫靶現(xiàn)象存在。綜上,表明dCas9-FokⅠ/sgRNA可以應(yīng)用于編輯大鼠基因,并能顯著提高特異性。盡管dCas9-FokⅠ/sgRNA系統(tǒng)相比于Cas9/sgRNA系統(tǒng),基因編輯效率有所下降,但是該技術(shù)的發(fā)展為基因治療提供了可供選擇的潛在工具。
[Abstract]:The discovery of CRISPR/Cas9 provides a powerful tool for gene editing in a variety of organisms. However, while providing targeted gene modification, the system can produce unwanted mutations, the miss phenomenon, in order to improve the specificity of CRISPR/Cas9. We fused the functional domain of wild-type Fok I nucleic acid endonucleases with the inactivated Cas9 protein dCas9, which was inactivated in the catalytic functional region. The fusion protein was used to reduce the miss effect. Fok 鈪，

本文編號(hào)：1678341