本文選題：剛地弓形蟲(chóng)　切入點(diǎn)：棒狀體蛋白　出處：《中國(guó)病原生物學(xué)雜志》2017年01期

【摘要】：目的構(gòu)建剛地弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白16(TgROP16)、棒狀體蛋白18(TgROP18)復(fù)合基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒,并驗(yàn)證其在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法重組質(zhì)粒pVAX1-ROP16與pVAX1-ROP18分別經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ、NheⅠ和AflⅡ雙酶切,將ROP16與ROP18基因先后克隆至雙啟動(dòng)子真核表達(dá)載體質(zhì)粒pVAXD的多克隆位點(diǎn)中,構(gòu)建pVAXD-ROP16-ROP18重組質(zhì)粒。分別用雙酶切和PCR驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒及對(duì)照組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以此為模板進(jìn)行ROP16基因、ROP18基因與管家基因β肌動(dòng)蛋白基因的RT-PCR擴(kuò)增,采用間接免疫熒光法檢測(cè)各自基因的表達(dá)。結(jié)果重組質(zhì)粒pVAXD-ROP16-ROP18經(jīng)PCR及雙酶切鑒定構(gòu)建正確。轉(zhuǎn)染后經(jīng)RT-PCR檢測(cè),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組β-肌動(dòng)蛋白基因擴(kuò)增產(chǎn)物均與預(yù)期大小相符,實(shí)驗(yàn)組ROP16基因、ROP18基因擴(kuò)增產(chǎn)物分別為1 700bp和2 100bp,與預(yù)期大小相符,而對(duì)照組均未擴(kuò)增出ROP16及ROP18基因。間接免疫熒光法檢測(cè)顯示,重組質(zhì)粒pVAXD-ROP16、pVAXD-ROP18轉(zhuǎn)染組細(xì)胞可見(jiàn)綠色熒光,空質(zhì)粒及對(duì)照組無(wú)綠色熒光。結(jié)論成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pVAXD-ROP16-ROP18,該質(zhì)�？稍谡婧思�(xì)胞中表達(dá)。
[Abstract]:Objective to construct the Toxoplasma gondii rhoptry protein 16 (TgROP16), rhoptry protein 18 (TgROP18) recombinant eukaryotic expression plasmid encoding complex gene, and verify its expression in eukaryotic cells. Methods the recombinant plasmid pVAX1-ROP16 and pVAX1-ROP18 respectively by EcoR I and Not I, Nhe I and Afl II double enzyme digestion. Multiple cloning sites ROP16 and ROP18 genes were cloned into the dual promoter eukaryotic expression plasmid pVAXD to construct the recombinant plasmid of pVAXD-ROP16-ROP18, respectively. The correct recombinant plasmid by double enzyme digestion and PCR verification and control group was transfected into Hela cells. The cell total RNA extraction and reverse transcription cDNA, ROP16 gene was used as a template ROP18, gene and the housekeeping gene beta actin gene was amplified by RT-PCR, the expression of the respective genes detected by indirect immunofluorescence. Results the recombinant plasmid pVAXD-ROP16-ROP18 PCR and double enzyme digestion. After transfection, Gou Jianzheng By RT-PCR detection, the experimental group and the control group of beta actin gene amplification were consistent with the expected size, experimental group, ROP16 gene, ROP18 gene amplification products were 1 700bp and 2 100bp, consistent with the expected size, while the control group were not amplified ROP16 and ROP18 genes. Indirect immunofluorescence detection showed. The recombinant plasmid pVAXD-ROP16 pVAXD-ROP18 transfected cells showed green fluorescence, empty plasmid control group and no green fluorescence. Conclusion: the recombinant plasmid pVAXD-ROP16-ROP18, the plasmid can be expressed in eukaryotic cells.

【作者單位】： 河北北方學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)研究所;
【基金】：河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2013405091) 河北北方學(xué)院校級(jí)重大課題(No.ZD201312)
【分類(lèi)號(hào)】：R382.5

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6 孔t，

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