本文選題：胰腺癌　切入點：轉(zhuǎn)移　出處：《南京醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：目的胰腺癌是一種惡性程度高、易早期轉(zhuǎn)移、預后極差的消化系統(tǒng)腫瘤。深入研究胰腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移機制,對于控制其進展,改善預后具有重要意義。慢性胰腺炎是胰腺癌發(fā)生的危險因素,有研究表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與慢性炎癥疾病及腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。研究發(fā)現(xiàn),配對相關源框1(paired related homeobox 1, Prrx1)基因在肺癌、結(jié)腸癌和甲狀腺癌中多種實體瘤中高表達,且其高表達與癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移正相關。但該基因在胰腺癌中研究甚少,分子機制尚不清楚。本研究旨在通過臨床組織水平和離體細胞水平的研究,闡明Prrx1基因在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制,為臨床探索胰腺癌基因治療的分子靶點提供新的思路。方法(一)臨床研究：收集胰腺癌、慢性胰腺炎以及正常胰腺組織標本,應用免疫組織化學法分別檢Prrx1和EMT相關分子E-cadherin、Vimentin蛋白表達情況,分析不同組織中Prrx1、E-cadherin、Vimentin陽性表達率的差異,并分別分析Prrx1陽性表達率及E-cadherin、Vimentin陽性表達率與胰腺癌病理學特征之間的關系,進一步探討Prrx1陽性表達率與E-cadherin、Vimentin陽性表達率之間是否具有相關性；(二)細胞學研究(1)培養(yǎng)人正常胰腺導管上皮細胞HPDE6-C7和3株胰腺癌細胞(AsPC-1、BxPC-3和CFPAC-1),采用Western Blot方法檢測Prrx1蛋白在細胞株中表達情況；(2)根據(jù)Prrx1基因mRNA特點,設計并合成3個小干擾RNA(siRNA),轉(zhuǎn)染胰腺癌BxPC-3細胞,采用熒光實時定量PCR方法篩選下調(diào)效果最好的siRNA。(3)采用Prrx1基因過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染胰腺癌BxPC-3細胞,構(gòu)建穩(wěn)定高表達Prrx1基因過表達細胞(簡稱為Prrx1過表達細胞),分別采用熒光實時定量PCR和Western Blot方法檢測癌細胞Prrx1基因(?)RNA和蛋白水平；采用顯微鏡觀察癌細胞形態(tài)；分別采用Western Blot和免疫熒光方法檢測各組癌細胞中E-cadherin和Vimentin蛋白情況；采用平板克隆方法觀察癌細胞增殖情況,采用劃痕修復試驗觀察癌細胞遷移情況,采用Transwell方法觀察癌細胞侵襲能力；(4)采用Prrxl基因siRNA轉(zhuǎn)染Prrx1過表達細胞后,分別采用熒光實時定量PCR和Western Blot方法檢測癌細胞Prrx1基因nRNA和蛋白水平；采用顯微鏡觀察癌細胞形態(tài)；分別采用Western Blot方法和免疫熒光方法檢測各組癌細胞中E-cadherin和Vimentin蛋白情況；采用平板克隆方法觀察癌細胞增殖情況,采用劃痕修復試驗觀察癌細胞遷移情況,采用Transwell方法觀察癌細胞侵襲能力。(5)癌細胞發(fā)生EMT涉及許多信號途徑,為了進一步了解Prrx1基因調(diào)控癌細胞中生物學行為的分子機制,本研究進一步以BxPC-3過表達細胞為對照組,試驗組分別采用]PI3K-Akt通路抑制齊JLY294002、NF-κB通路抑制劑PDTC以及Wnt通路抑制劑XAV939處理Prrx1 BxPC-3過表達細胞后,采用Western Blot方法檢鋇Prrx1和EMT相關分子的蛋白表達情況,從而初步探討Prrx1通過哪些通路誘導EMT發(fā)生。結(jié)果(一)臨床組織學研究結(jié)果 研究發(fā)現(xiàn),胰腺癌組織中Prrx1蛋白陽性表達率較慢性胰腺炎和正常胰腺組織顯著升高(尸值均0.05),并與患者年齡、腫瘤脈管淋巴管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及5年生存率相關(P值均0.05),而與患者性別、腫瘤位置、分化程度及腫瘤的浸潤深度無關(P值均0.05)；進一步分析發(fā)現(xiàn),Prrx1陽性表達與E-cadherin高表達之間呈負相關(P0.01,R-0.401)。 Prrx1陽性表達與Vimentin高表達之間呈正相關(P0.01,R0.361)。統(tǒng)計學分析結(jié)果提示,Prrx1基因過表達與EMT有關。(二)細胞學研究結(jié)果(1)培養(yǎng)人正常胰腺導管上皮細胞和3株胰腺癌細胞,采用Western Blot方法檢測Prrx1蛋白在細胞株中表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Prrx1蛋白在HPDE-C7細胞表達極低,而在AsPC-1、BxPC-3和CFPAC-1均高表達。我們選取BxPC-1做進一步研究。(2)采用熒光實時定量PCR和Western Blot方法檢測發(fā)現(xiàn),篩選下調(diào)效果最好的siRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn),以siRNA-b下調(diào)Prrx1基因效果最好。本研究將采用siRNA-b為工具,觀察siRNA-b轉(zhuǎn)染對Prrx1過表達細胞株生物學行為的影響及分子機制。(3)成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達Prrx1胰腺癌BxPC-3細胞(簡稱Prrxl過表達細胞)。采用熒光實時定量PCR和Western Blot方法檢測發(fā)現(xiàn),與空白對照組比較,Prrx1過表達組細胞Prrx1基因nRNA和蛋白水平明顯升高；形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn),Prrx1基因過表達組細胞由鵝卵石形變?yōu)榧忓N形,即出現(xiàn)EMT改變；Western blot結(jié)果顯示,與空白對照組比較,Prrx1過表達組細胞上皮標志物E-Cadherin表達下調(diào),間葉標記物Vimentin表達上調(diào)；免疫熒光結(jié)果進一步證實了過表達Prrx1:造成E-cadherin下調(diào)及Vimentin上調(diào)。以上結(jié)果表明Prrx1過表達能促進胰腺癌細胞EMT的發(fā)生,提示Prrx1基因過表達組細胞發(fā)生了EMT。(4)平板克隆試驗、劃痕修復試驗和Transwell方法檢測發(fā)現(xiàn),與空白對照組比較,Prrx1基因過表達組細胞增殖、遷移和侵襲能力明顯升高。(5)采用siRNA-b轉(zhuǎn)染Prrx1過表達細胞后,分別采用熒光實時定量PCR和Western Blot方法檢測發(fā)現(xiàn),與Prrx1過表達組比較,siRNA轉(zhuǎn)染組細胞Prrx1基因]mRNA和蛋白水平明顯下調(diào),說明轉(zhuǎn)染成功；形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn),Prrx1基因過表達組細胞紡錘形變?yōu)轾Z卵石形,即EMT現(xiàn)象出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)；Western blot結(jié)果顯示,與Prrx1過表達組比較,siRNA組細胞上皮標志物E-Cadherin表達升高,間葉標記物Vimentin表達降低；免疫熒光結(jié)果進一步證實了siRNA轉(zhuǎn)染造成E-cadherin升高及Vimentin降低。以上結(jié)果表明,采用siRNA下調(diào)Prrx1基因表達后,Prrx1過表達細胞EMT出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。(6)平板克隆試驗、劃痕修復試驗和Transwell方法檢測發(fā)現(xiàn),與]Prrx1過表達組比較,siRNA轉(zhuǎn)染組細胞增殖、遷移和侵襲能力明顯降低。(7)信號通路抑制試驗證實,Prrx1至少可通過NF-κB和Wnt兩條信號通路介導胰腺癌細胞發(fā)生EMT。結(jié)論(1) Prrx1基因與胰腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關,可能是一種新的胰腺癌轉(zhuǎn)移促進因子。(2) Prrx1通過誘導EMT發(fā)生,增強胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力。(3) NF-κB和Wnt信號途徑的激活,參與了Prrx1調(diào)控胰腺癌細胞發(fā)生EMT。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.9

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1 鄒晨;Prrx1基因在胰腺癌EMT中的作用及機制研究[D];南京醫(yī)科大學;2016年

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本文編號：1657042