發(fā)布時間：2018-03-19 21:42

  本文選題：Alu元件　切入點：生物信息學分析　出處：《河北醫(yī)科大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:RNA對基因表達的影響主要包括抑制和活化基因兩個方面,這些工作在數(shù)十年前就引起了生物學家的重視,近年來在RNA活化基因(RNA激活)方面的資料在不斷積累。為了研究重復序列在活化基因中的作用,本研究中,使用不同組合的Alu重復序列,例如,兩個Alu基因位于同一質(zhì)�；虿煌|(zhì)粒組合,正義和反義Alu組合等,穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染He La細胞,觀察重復序列對EGFP報告基因表達的影響;使用生物信息學分析方法,比較人類C組染色體著絲粒與其側(cè)翼DNA序列的RNA群結(jié)合強度,研究重復序列在RNA激活中的作用,并推理RNA激活的機理。方法:1報告質(zhì)粒和誘導質(zhì)粒的構(gòu)建2 PSI-rTetR質(zhì)粒的構(gòu)建3細胞轉(zhuǎn)染包括瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,詳細方法見正文。4熱休克處理5熒光顯微鏡觀察將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染He La細胞后,在熒光顯微鏡下觀察EGFP熒光陽性細胞,并進行照相,計算EGFP表達量。6流式細胞儀檢測7序列資料和軟件從NCBI人類基因組數(shù)據(jù)庫中獲得序列資料,用本研究室編寫的軟件(Gene-Analyser2.0)分析7-nt序列。8計算RNA群結(jié)合強度的方法RNA群結(jié)合強度的算法是基于互補的RNA和DNA越多,RNA和DNA結(jié)合的可能性越大的原理來進行計算。具體的計算方法見正文。9 Tet-on系統(tǒng)構(gòu)建Mini-C1-Alu-sense-sense(mini-Alu正正組合)等質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染He La細胞用G418穩(wěn)定篩選,再轉(zhuǎn)染PSI-rTetR質(zhì)粒,用Puro穩(wěn)定篩選。得到G418和Puro雙抗性的細胞。這些細胞加入Dox和不加Dox進行培養(yǎng),觀察EGFP表達量。10統(tǒng)計學處理組間的比較使用均值±SD和t檢驗。所有的實驗重復只少三次,P0.05認為兩組有統(tǒng)計學差異。流式細胞儀分析圖是至少3次獨立實驗的一個代表圖。結(jié)果:1質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建及鑒定本研究構(gòu)建了五類表達載體:1.1基于p EGFP-C1質(zhì)粒構(gòu)建的表達載體,為報告質(zhì)粒(Fig.1A,Table 1)。1.2基于pc DNA3.1構(gòu)建的表達載體,為瞬時轉(zhuǎn)染時的誘導質(zhì)粒(Fig.1B,Table 1)。1.3基于PSI構(gòu)建的表達載體,為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時的誘導質(zhì)粒(Fig.1C,Table1)。1.4 mini-C1報告質(zhì)粒(Fig.1D,Table 1)1.5 PSI-rTetR質(zhì)粒,用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實驗(Fig.1E,Table 1)。2正義Alu和反義Alu組合后活化EGFP報告基因2.1正反組合的Alu重復序列對EGFP報告基因表達的影響Fig.2顯示正反組合的Alu序列在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時活化EGFP報告基因,然而將這些質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染He La細胞時,正反組合的Alu元件沒有活化EGFP基因表達的作用。當兩個基因位于不同質(zhì)粒,不論瞬時還是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,正反組合的Alu元件均沒有明顯活化基因作用(Table 4-7)。這些結(jié)果說明,Alu元件活化基因必需正反組合,必需位于同一質(zhì)粒,且必需穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。2.2 Alu同源序列對EGFP報告基因表達的影響將C1-Alu-sense-Alu JB-sense(Alu正Alu JB正組合),C1-Alu-senseAlu JB-antisense(Alu正Alu JB反組合)(Table 1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染He La細胞,Fig.3顯示兩個質(zhì)粒的EGFP表達量沒有明顯差異,這兩個質(zhì)粒的EGFP基因表達量顯著低于Alu正反組合的質(zhì)粒,說明組合的正義Alu和反義Alu JB元件沒有顯著活化基因作用。3熱休克對EGFP報告基因表達的影響將質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染He La細胞后進行熱休克處理,培養(yǎng)不同時間,觀察EGFP報告基因的表達。Fig.4顯示熱休克使Alu正Alu JB反組合質(zhì)粒的EGFP表達量顯著上升,在熱休克第2-4天達高峰,然后下降,在12天回到熱休克前的水平。熱休克對Alu正反組合質(zhì)粒中的EGFP基因表達也有顯著促進作用,雖不如Alu正Alu JB反質(zhì)粒表現(xiàn)明顯,但是Alu正反組合的熱休克反應可以維持更長時間,到熱休克第20天,EGFP的表達仍然處于較高水平。將其它的對照質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細胞后也進行熱休克處理,熱休克4天后測定EGFP的表達量,Fig.5-Fig.6的結(jié)果說明其它組合時,熱休克均沒有使這些質(zhì)粒中的EGFP基因的表達顯著提高,而且與正反組合無關(guān)。4 Tet-on系統(tǒng)實驗進一步論證了正反組合的Alu序列活化EGFP報告基因的觀點(詳細實驗內(nèi)容見正文)。5 C組染色體著絲粒的RNA群結(jié)合強度低本研究利用生物信息學分析模擬RNA群與著絲粒序列及其側(cè)翼序列的結(jié)合強度。關(guān)于RNA群結(jié)合強度的具體計算方法見正文。Fig.8和Table 8的結(jié)果顯示著絲粒序列的RNA群的結(jié)合強度明顯低于側(cè)翼序列。結(jié)論:1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗證明,轉(zhuǎn)錄的正反組合的Alu重復序列在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時能激活EGFP基因表達。熱休克使Alu正反,Alu正Alu JB反質(zhì)粒中的EGFP基因的表達顯著上升,但是Alu正反質(zhì)粒較Alu正Alu JB反質(zhì)粒能維持較長時間。2生物信息學分析顯示C組染色體著絲粒的RNA群結(jié)合強度顯著低于其側(cè)翼序列。著絲粒的低RNA群結(jié)合強度的結(jié)果與提出的RNA激活基因的實驗結(jié)果一致。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q811.4

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本文編號：1636127