本文選題：分子標記物　切入點：循環(huán)游離DNA　出處：《鄭州大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,每年累及超過60萬人的生命,成為最為常見的腫瘤相關死亡病因之一[1,2]。HCC的致病因素復雜,常見的HCC高危因素有慢性肝炎病毒感染,包括HBV和HCV的感染,長期大量攝入酒精及暴露于致癌物質(zhì)如黃曲霉素B等[3]。近些年,肥胖和糖尿病引起的非酒精性脂肪性肝炎相關HCC的發(fā)病率有上升趨勢[4]。HCC發(fā)病隱匿、臨床癥狀不典型,早期診斷率低,目前對于早期HCC主要的治療方式是手術切除,輔以射頻消融、化療栓塞等治療,但患者術后復發(fā)率高,有50%-70%的患者在術后5年內(nèi)復發(fā)或轉(zhuǎn)移[5,6]。中晚期HCC患者治療選擇非常有限;肝移植是治療HCC的有效方式,但由于供肝短缺,受益患者范圍有限;索拉非尼能夠使晚期肝癌患者受益,但是有效率較低。因此近些年的研究顯示,手術治療聯(lián)合免疫治療、分子靶向治療的HCC綜合治療模式是未來HCC精準治療的發(fā)展方向[7,8]。由于HCC發(fā)病因素復雜,形成了具有高度異質(zhì)性的腫瘤微環(huán)境,表現(xiàn)在不同患者間腫瘤存在差異、同一患者不同病灶及同一腫瘤結節(jié)內(nèi)部細胞存在異質(zhì)性[9],因此需要制定針對HCC患者個體腫瘤分子病理分型的個體化治療方案,可以避免盲目用藥和不必要的藥物毒副作用。腫瘤個體化治療需要在治療前制定針對性的治療方案,還需要在治療過程中對腫瘤患者進行實時、動態(tài)的監(jiān)測。目前臨床上常用的HCC監(jiān)測方式包括血清AFP測定和超聲檢查,但其對早期HCC的診斷敏感性只有40%-50%,CT、MRI檢查在臨床上可選,但由于檢查費用較高、本身輻射作用強及患者依存性較差而不易反復多次進行[6,10]。此外,傳統(tǒng)HCC監(jiān)測方式不能反映腫瘤內(nèi)部和腫瘤之間的異質(zhì)性,因此迫切需要研發(fā)出用于肝癌早期診斷和實時動態(tài)監(jiān)測的生物標志物。目的:評估基于第二代測序技術的肝癌相關基因變異檢測是否可以用于分析肝癌的分子分型,觀察肝癌細胞系腫瘤相關基因的變異,是否可用于肝癌的伴隨分子診斷手段。材料和方法:本研究分為兩個部分,第一部分,利用基于第二代測序技術的目標基因靶向測序技術,對7個常見hcc細胞系dna325個腫瘤相關基因進行捕獲測序。分析dna中的腫瘤相關突變基因及突變負荷率,比對出差異基因,以及差異基因的突變趨勢。第二部分選擇收集鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院(河南省腫瘤醫(yī)院)肝膽胰腺外科29例外科手術治療的hcc患者標本,包括術前1天血漿標本、外周血白細胞(pbmc)及手術切除的腫瘤組織和癌旁組織。選用覆蓋第一部分的50個常見腫瘤原癌基因和抑癌基因的擴增子試劑盒,基于illuminahiseqxten測序平臺,對血漿cfdna、腫瘤組織dna及癌旁組織dna進行靶向擴增子測序,納入等位基因突變頻率(mutantallelefrequency,maf)高于1%的基因位點。比較hcc患者術前血漿cfdna、腫瘤組織dna及癌旁組織dna的高頻突變基因的變異,pbmc來源的基因組dna作為對照用于排除生殖細胞變異。同時對血漿cfdna中基因突變與患者腫瘤負荷進行相關性分析。結果:本研究的第一部分,本研究采用基于腫瘤基因捕獲的高通量測序技術檢測7種肝癌細胞株(huh-7,hep3b,sk-hep-1,mhcc97h,mhcc97l,hepg2,hepg2.2.15)的體細胞突變。采用包含325個腫瘤相關基因panel的羅氏nimblegen定制序列捕獲系統(tǒng),對細胞株樣本進行目標區(qū)域的捕獲和雙端測序。測序結果顯示目標區(qū)域平均覆蓋率達99.7%,平均測序深度約1000×,共檢出100個基因發(fā)生突變,包括344個非同義突變。其中有38個與癌癥密切相關的突變基因富集于5條致癌信號通路:染色質(zhì)重塑,notch,mapk,p53和wnt/β-catenin通路。與hcc患者體細胞突變的前期報道比較,肝癌細胞株中染色質(zhì)重塑和notch信號通路中基因突變負荷更高。四種來自不同hcc患者建系的肝癌細胞株(huh-7,hep3b,sk-hep-1,hepg2)有不同突變模式,但同一個克隆來源的肝癌細胞株突變呈現(xiàn)較大相似性。本研究的第二部分前瞻性的觀察了靶向測序技術可檢測到腫瘤相關高頻突變基因。28例患者腫瘤組織中有27例(96%)樣本檢測到至少2個基因突變(中位突變基因數(shù)6,2-18不等),1例患者腫瘤組織未測到任何基因的突變,腫瘤組織中檢測到的35個突變基因中,以tp53、atm、alk的突變頻率最高,分別是50%(14/28)、39%(11/28)和39%(11/28);全部29例(100%)患者血漿cfdna中檢測到腫瘤相關基因突變(中位突變基因數(shù)27,6-47不等),其中包括大量低頻突變基因。比較同一患者腫瘤組織dna和術前血漿cfdna的基因突變,發(fā)現(xiàn)28例有配對樣本的患者中,21例(21/28,75%)患者血漿cfdna與腫瘤組織dna中檢測到至少一個完全一致的基因突變,其中以tp53、pdgfra、kit、及npm1突變頻率最高,分別是33%(7/21)、23.8%(5/21)、19%(4/21)及19%(4/21);7例(7/28,25%)患者血漿cfdna與腫瘤組織dna中未檢測到一致的基因突變,其中1例患者腫瘤組織dna中未檢測到任何基因的突變,其血漿cfdna中檢測到包括cdkn2a、egfr等基因在內(nèi)的低頻突變。此外,28例有配對樣本的hcc患者中,17例(17/28,61%)患者癌旁組織dna中檢測到與腫瘤組織dna中完全一致的基因突變,其中14例(14/17,82%)患者腫瘤組織dna與癌旁組織dna一致的突變基因在血漿cfdna中可檢測到,其中高頻突變基因包括pdgfra、kit及npm1等基因。比較afp水平與血漿cfdna突變檢測的結果顯示,29例患者中有14例(48.3%)患者afp陽性(20ng/ml),24例(82.7%)患者血漿cfdna中檢測到腫瘤相關基因突變及15例afp陰性患者中有13例(86.7%)患者血漿cfdna中檢測到腫瘤相關基因突變;并且血漿cfdna和腫瘤組織dna有一致突變基因的患者血清afp水平顯著高于非一致突變組患者,兩組患者afp水平中位值分別是144ng/ml和2.5ng/ml(p=0.016)。本研究中,血漿cfdna濃度與患者臨床病理特征無直接相關性,而腫瘤直徑5cm組患者中tp53、ctnnb1、pik3ca及cdkn2a基因的maf水平高于腫瘤直徑5cm組患者,且腫瘤多發(fā)或伴隨轉(zhuǎn)移的腫瘤患者中tp53、ret、fgfr3及apc基因的maf水平較腫瘤單發(fā)組患者。結論:1.本研究通過對肝癌細胞株進行腫瘤相關基因捕獲測序,明確了實驗室常用肝癌細胞模型的體細胞突變,也初步揭示相同和不同克隆來源的肝癌細胞株的突變模式。2.HCC患者血漿cfDNA可能替代腫瘤組織活檢,作為HCC突變基因篩查的分子標志物;本研究中HCC患者血漿cfDNA中基因突變的MAF水平與腫瘤負荷顯著相關,提示血漿cfDNA可能成為HCC輔助診斷的分子標志物。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：1622456