本文選題：骨肉瘤　切入點：ARHI　出處：《蘭州大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：骨肉瘤(Oseteosarcoma)亦稱為成骨肉瘤,是一種常見于兒童和青少年時期的惡性原發(fā)性骨腫瘤。早期即可發(fā)生廣泛的肺轉(zhuǎn)移,死亡率高,是導致兒童和青少年死亡的最常見的疾病之一。其總體發(fā)病率各國統(tǒng)計數(shù)字差異較大,約1/10萬~0.1/10萬。盡管當前新的輔助化療及手術(shù)技術(shù)有了進一步的發(fā)展和提高,骨肉瘤患者的生存率也因此顯著提高了,但仍有部分患者會出現(xiàn)化療效果差,容易復發(fā)和轉(zhuǎn)移的情況。近年來,隨著分子生物學研究和技術(shù)的不斷發(fā)展,骨肉瘤的最新研究已進入基因治療、靶向治療階段,從分子水平研究腫瘤中相關(guān)基因的表達對腫瘤的發(fā)生、演變、轉(zhuǎn)歸及治療具有重要意義。目前在腫瘤生物基因靶向治療及信號轉(zhuǎn)導通路作用機制的研究方面出現(xiàn)了許多新的進展,這為我們對骨肉瘤的預防和治療提供了新的方法和途徑。ARHI(aplasia ras homologue member I),是一個母源性印記基因。它又被稱為Di Ras3或NOEY2,于1999年被首次發(fā)現(xiàn)。近年來研究表明,其編碼蛋白在人類的胰腺、乳腺、卵巢等多個組織中存在著不同的表達。但是,它在胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌等多種腫瘤中則表現(xiàn)為表達缺失或下調(diào),提示ARHI基因與上述腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。ARHI基因作為一個抑癌基因,其在調(diào)控腫瘤細胞的生長增殖、侵襲遷移以及誘導細胞凋亡、干預細胞信號轉(zhuǎn)導通路等方面扮演著重要角色。ARHI作為一種新的研究目的基因,為腫瘤的分子水平基因治療探索提供了新的思路。ARHI基因在腫瘤中的應用研究尚處于初始階段,迄今在國內(nèi)外的研究領域尚無關(guān)于骨肉瘤中ARHI基因的表達和ARHI基因?qū)侨饬錾飳W特性影響及相關(guān)機制研究的文獻報道。鑒于上述原因,本實驗將通過構(gòu)建目的基因ARHI穩(wěn)定表達的骨肉瘤MG-63、U2OS和SAOS-2細胞系,對ARHI基因在骨肉瘤細胞中的表達情況作以研究,并以此為依據(jù),深入探討ARHI基因?qū)侨饬錾飳W特性的影響及其作用機制,以期為骨肉瘤的基因診斷及治療提供更多理論支撐和依據(jù)。本研究共分為四部分:第一部分ARHI基因在人骨肉瘤細胞及正常成骨細胞中的表達及意義目的:研究ARHI基因在人骨肉瘤細胞及正常成骨細胞中的表達情況,探討ARHI基因在人骨肉瘤中表達的生物學意義。方法:分為3種人骨肉瘤細胞系(MG-63、U2OS、SAOS-2)和人正常成骨細胞h FOB1.19,采用RT-PCR和Western blot法分別檢測ARHI基因m RNA和蛋白的表達情況,對結(jié)果進行統(tǒng)計分析,揭示在正常的成骨細胞中是否存在ARHI基因的表達以及其在人骨肉瘤細胞中表達的變化情況。結(jié)果:(1)應用RT-PCR和Western blot法分別檢測了骨肉瘤細胞系中ARHI基因m RNA及蛋白表達情況,結(jié)果顯示其內(nèi)均存有不同程度ARHI基因表達。(2)RT-PCR顯示骨肉瘤細胞系中ARHI m RNA表達水平低于正常成骨細胞,以MG-63細胞下降最為顯著,表達水平有顯著性差異(P0.05)。(3)Western blot法檢測結(jié)果:骨肉瘤細胞系中ARHI蛋白表達水平低于正常成骨細胞,以MG-63細胞下降最為顯著,表達水平有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:ARHI基因在骨肉瘤細胞系中普遍低表達,提示其表達可能與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),影響骨肉瘤的生物學行為。第二部分ARHI基因轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞陽性克隆穩(wěn)定株的構(gòu)建及鑒定目的:構(gòu)建穩(wěn)定表達目的基因ARHI的骨肉瘤細胞系模型并進行鑒定,為研究ARHI基因?qū)侨饬黾毎飳W行為的影響奠定基礎。方法:應用基因克隆技術(shù),構(gòu)建真核表達載體pc DNA3.1-ARHI(攜帶目的基因ARHI基因編碼序列),將ARHI基因重組質(zhì)粒pc DNA3.l-ARHI和空載體質(zhì)粒pc DNA-3.1分別經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌、質(zhì)粒提取擴增和純化鑒定后,采用脂質(zhì)體法分別瞬時轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞系MG-63、U2OS、SAOS-2,通過G418篩選,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ARHI基因的骨肉瘤細胞系模型。擴增培養(yǎng)后應用RT-PCR及Western blot法分別檢測骨肉瘤MG-63、U2OS、SAOS-2細胞轉(zhuǎn)染前后目的基因ARHI在m RNA和蛋白表達水平的變化。結(jié)果:(1)真核表達質(zhì)粒pc DNA3.l-ARHI轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞系和空載體pc DNA3.l轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞系均獲得新霉素抗性,通過G418篩選,建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ARHI基因的骨肉瘤細胞系。(2)通過RT-PCR、Western blot法檢測顯示重組質(zhì)粒pc DNA3.l-ARHI轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞系后,目的基因ARHI在m RNA和蛋白質(zhì)水平上的表達均較空載體組和未轉(zhuǎn)染組有顯著增高(P0.05),而空載體組和未轉(zhuǎn)染組的ARHI表達則沒有明顯不同(P0.05)。結(jié)論:應用基因克隆技術(shù)在體外成功構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達目的基因ARHI的骨肉瘤細胞系。第三部分ARHI基因調(diào)控骨肉瘤細胞增殖、凋亡、侵襲遷移的體外研究目的:研究目的基因ARHI對骨肉瘤細胞增殖、凋亡及侵襲遷移的影響,證實其在骨肉瘤中的生物學作用。方法:以成功構(gòu)建的分別能穩(wěn)定表達外源pc DNA3.1-ARHI、空載體pc DNA3.1的骨肉瘤細胞系和未轉(zhuǎn)染的骨肉瘤細胞系為研究對象。(1)通過生長曲線和MTT法分析ARHI基因?qū)侨饬黾毎鲋车挠绊?(2)流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測ARHI基因?qū)侨饬黾毎蛲龅挠绊憽?3)通過Transwell小室侵襲實驗和Transwell小室遷移實驗研究ARHI基因?qū)侨饬黾毎忠u遷移的影響。結(jié)果:(1)從骨肉瘤MG-63、U2OS、SAOS-2細胞的生長曲線數(shù)據(jù)分析,ARHI組細胞生長速度要比空載體組明顯減慢,ARHI基因抑制了骨肉瘤細胞的生長,尤其在72~96h,與空載體組比較,具有明顯的差異性(P0.05)。(2)應用MTT法檢測細胞生長,可見ARHI組細胞生長明顯減慢,對MG-63、U2OS和SAOS-2細胞均有明顯的生長抑制作用,ARHI組與空載體組比較,具有明顯的差異性(P0.05)。(3)Annexin V-FITC/PI雙染色后用流式細胞儀檢測骨肉瘤細胞凋亡情況,定量分析骨肉瘤MG-63細胞的凋亡率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ARHI組MG-63凋亡細胞的百分率為29.7%,空載體組為4.31%。與空載體組比較,ARHI基因明顯增加了細胞凋亡百分率(P0.05)。(4)通過Transwell侵襲實驗可以觀察到MG-63細胞在ARHI組較空載體組細胞侵襲能力明顯下降(P0.05);通過Transwell遷移實驗可以觀察到MG-63細胞在ARHI組較空載體組細胞遷移能力明顯下降(P0.05)。結(jié)論:(1)ARHI基因抑制骨肉瘤細胞的增殖;(2)ARHI基因誘導骨肉瘤細胞發(fā)生凋亡;(3)ARHI基因抑制骨肉瘤細胞的侵襲和遷移;(4)ARHI基因在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過程中是一個抑癌基因。第四部分小干擾RNA對骨肉瘤細胞ARHI基因、蛋白表達及細胞增殖、凋亡的影響以及ARHI基因?qū)I3K/Akt信號通路的影響目的:研究小干擾RNA對骨肉瘤MG-63細胞ARHI基因的表達水平及細胞增殖、凋亡的影響;研究ARHI基因?qū)I3K/Akt信號通路和Caspase凋亡信號通路的影響。方法:使用化學合成法構(gòu)建針對ARHI的小干擾RNA,通過使用dharmafect4轉(zhuǎn)染試劑將其轉(zhuǎn)染入ARHI高表達的骨肉瘤MG-63細胞。(1)通過RT-PCR、Western blot方法、MTT增殖實驗及流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測其對ARHI基因、蛋白表達水平及細胞增殖、凋亡的影響;(2)通過Western blot方法檢測ARHI基因?qū)I3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路中p-Akt和Akt蛋白表達的作用;(3)通過Caspase-Glo?3/7試驗檢測ARHI基因?qū)aspase-3活性的影響。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了針對ARHI基因的小干擾RNA;(2)通過RT-PCR檢測顯示,ARHI si RNA轉(zhuǎn)染MG-63細胞48h后,與control si RNA轉(zhuǎn)染組比較,ARHI si RNA轉(zhuǎn)染組細胞中ARHI m RNA的表達水平下降約92%,具有明顯差異性(P0.05);(3)通過Western blot方法檢測顯示,與control si RNA轉(zhuǎn)染組比較,ARHI si RNA轉(zhuǎn)染組MG-63細胞中ARHI蛋白表達水平下調(diào),具有明顯差異性(P0.05);(4)應用MTT比色法檢測顯示,ARHI si RNA轉(zhuǎn)染組細胞增殖較control si RNA轉(zhuǎn)染組有所增加,具有明顯差異性(P0.05);(5)流式細胞儀檢測顯示,ARHI si RNA轉(zhuǎn)染48h后MG-63細胞的凋亡率4.8%,明顯低于control si RNA轉(zhuǎn)染組31.1%,具有顯著差異性(P0.05);(6)在ARHI基因轉(zhuǎn)染MG-63細胞72h后,觀察p-Akt蛋白的表達,結(jié)果顯示骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)染ARHI基因后,與空載體比較,發(fā)現(xiàn)磷酸化的p-Akt蛋白表達明顯下調(diào),而通過RNAi技術(shù)使ARHI基因沉默則顯著上調(diào)了p-Akt蛋白表達,然而control si RNA轉(zhuǎn)染組p-Akt蛋白表達無明顯改變;(7)Caspase-Glo?3/7試驗檢測ARHI基因轉(zhuǎn)染組與ARHI基因沉默組細胞中Caspase-3活性均較對照組無顯著改變(P0.05)。結(jié)論:(1)成功地合成了ARHI si RNA并將其轉(zhuǎn)染入骨肉瘤MG-63細胞;(2)發(fā)現(xiàn)ARHI si RNA能下調(diào)骨肉瘤MG-63細胞ARHI基因和蛋白的表達水平,促進細胞增殖,抑制細胞凋亡;(3)ARHI基因下調(diào)了p-Akt蛋白的表達,通過抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路參與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過程;(4)ARHI基因引起MG-63細胞凋亡可能與Caspase途徑無關(guān),具體機制還需進一步研究。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R738.1
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本文編號：1610269