本文選題：冬凌草　切入點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序　出處：《河南中醫(yī)藥大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：1.選取合適的冬凌草材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析；2根據(jù)冬凌草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析并選擇冬凌草甲素、冬凌草乙素合成途徑中DXR、IDI、ISPF. ISPH基因,進(jìn)行大腸桿菌克隆、測(cè)序分析,獲得正確的基因序列信息；3.針對(duì)克隆測(cè)序的基因,分析其生物信息；4.分別對(duì)冬凌草無(wú)菌苗做不同部位的基因相對(duì)表達(dá)量分析；5.做原核表達(dá)分析,驗(yàn)證克隆測(cè)序后基因的翻譯蛋白分子量大小,并為后期蛋白功能分析奠定基礎(chǔ)。方法：1.首先將含冬凌草甲素、冬凌草乙素較低產(chǎn)地的冬凌草無(wú)菌苗進(jìn)行煉苗,使之能在室溫環(huán)境下進(jìn)行生長(zhǎng),然后分別在冬凌草葉片表面噴施不同濃度的茉莉酸甲酯,測(cè)量噴施后0h、6h、12h、24h、48 h、72h后的冬凌草甲素含量,進(jìn)而確認(rèn)含量變化最高點(diǎn)的材料。2.獲得冬凌草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后,根據(jù)冬凌草二萜類物質(zhì)合成代謝路徑,分別選擇5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶(1-deoxy -D- lxyluloses-pho sphatereduet oi someras e,DXR)、異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI).2-C-甲基赤蘚醇-2,4-環(huán)焦磷酸合成酶(2-C-methyl -D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase ISPF)、二 甲 基烯 丙 基焦 磷 酸合 成 酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reducta se ISPH)并分別設(shè)計(jì)克隆引物,做大腸桿菌克隆測(cè)序分析,獲得正確基因序列。3.根據(jù)測(cè)序結(jié)果,在線BLAST同源性基因序列并采用在線軟件進(jìn)行蛋白翻譯和生物信息分析。4.分別設(shè)計(jì)qRT-PCT引物,用熒光定量PCR儀做冬凌草無(wú)菌苗不同部位和添加刺激劑后脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)量分析。5.針對(duì)DXR、IDI、ISPF、ISPH基因設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物,采用PET-28 a載體、BL21感受態(tài)細(xì)胞,做原核表達(dá)分析。結(jié)果：1.添加不同濃度的刺激劑后發(fā)現(xiàn)在36h內(nèi)冬凌草甲素含量變化不明顯,因此采用本實(shí)驗(yàn)室前期多不同產(chǎn)地冬凌草的品質(zhì)評(píng)價(jià)后的含冬凌草甲素、冬凌草乙素較高(DLC-G)產(chǎn)地的冬凌草和含冬凌草甲素、冬凌草乙素較低(DLC-D)產(chǎn)地的冬凌草作為冬凌草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料。2.分別提取冬凌草DLC-G、DLC-D樣品的mRNA,以mRNA為模板,研究得到cDNA文庫(kù)。以cDNA文庫(kù)作為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料進(jìn)行測(cè)序分析。DLC-G獲得50934276 reads,GC含量為48.06%；DLC-D獲得61561674 reads,GC含量為48.13%。共獲得44626條unigenes。對(duì)GLC-G、GLC-D差異基因的表達(dá)分析表明,DLC-G、DLC-D2個(gè)樣品共找到差異表達(dá)基因1298條,上調(diào)基因有339條,下調(diào)基因959條。3. DXR、IDI、ISPF、ISPH基因經(jīng)過(guò)大腸桿菌克隆測(cè)序分析,獲得了基因的序列,測(cè)序后的基因片段通過(guò)在線BLAST同源基因,最終確定下來(lái)了所選擇基因(DXR、IDI、ISPF、ISPH)的基因序列信息。4.序列翻譯后,發(fā)現(xiàn)DXR基因開放閱讀匡為1422bp,編碼473個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列,蛋白分子量為51390.2,等電點(diǎn)為6.09；IDI基因開放閱讀匡為906bp,編碼301個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列,蛋白分子量為27444.3,等電點(diǎn)為5.06；ISPF基因開放閱讀匡為708bp,編碼196個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列,蛋白分子量為20870.1,等電點(diǎn)為6.75；ISPH基因開放閱讀匡為1389bp,編碼462個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列,蛋白分子量為52094.0,等電點(diǎn)為5.82。5.不同部位基因表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)DXR基因在莖的表達(dá)量相對(duì)于根、葉較高,基本是其2倍,IDI基因在葉中的表達(dá)量較高,而在根和莖的表達(dá)量相差不大,ISPF基因在葉中的表達(dá)量最高,基本是在根中表達(dá)量的5倍,而其在莖中的表達(dá)量也基本是在根中表達(dá)量的3.8倍,ISPH基因在根、莖、葉中的表達(dá)量基本相同,三者之間差別不大；對(duì)于脅迫表達(dá)分析,茉莉酸甲酯促進(jìn)DXR等4條基因的表達(dá),只是表達(dá)量不明顯,而赤霉素ATP、稀土元素鑭和鈰抑制其表達(dá),其中赤霉素的抑制作用最強(qiáng)。6.通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜后,做蛋白SDS-PAGE分析,誘導(dǎo)出了DXR、 ISPF、DXS基因蛋白。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R284

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙德剛;李巖;趙懿琛;趙丹;呂立堂;劉世會(huì);宋莉;董璇;馮怡;;杜仲雌雄株轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋[J];山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào);2015年01期

2 趙航;賈富強(qiáng);張富春;王艷;;鹽脅迫下鹽穗木差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄組信息分析[J];生物信息學(xué);2014年02期

3 孫穎;譚曉風(fēng);羅敏;李建安;;油桐花芽2個(gè)不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組分析[J];林業(yè)科學(xué);2014年05期

4 高世勇;王瓏;;冬凌草的化學(xué)和藥理作用研究[J];哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年01期

5 蘇秀紅;董誠(chéng)明;史應(yīng)強(qiáng);陳隨清;馮衛(wèi)生;張麗萍;劉春朝;;離體條件下培養(yǎng)物中冬凌草甲素積累與其組織結(jié)構(gòu)關(guān)系[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2014年03期

6 孫全;蔡應(yīng)繁;何曉紅;曾鑫;江懷仲;王微娜;;莖瘤芥根和莖組織轉(zhuǎn)錄組比較分析[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2013年05期

7 黃海燕;杜紅巖;烏云塔娜;劉攀峰;;基于杜仲轉(zhuǎn)錄組序列的SSR分子標(biāo)記的開發(fā)[J];林業(yè)科學(xué);2013年05期

8 陳隨清;宋君;崔璨;;冬凌草二萜類成分的化學(xué)指紋圖譜研究及評(píng)價(jià)[J];植物科學(xué)學(xué)報(bào);2012年05期

9 羅曉錚;董誠(chéng)明;葉娟;;光質(zhì)對(duì)冬凌草無(wú)菌苗生長(zhǎng)及冬凌草甲素含量的影響[J];時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥;2012年02期

10 陳隨清;崔璨;裴莉昕;董誠(chéng)明;馮衛(wèi)生;;不同產(chǎn)地和來(lái)源冬凌草藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2011年17期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 王麗鴛;基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的茶樹DNA分子標(biāo)記開發(fā)與應(yīng)用研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

2 高偉;丹參酮類化合物生物合成相關(guān)酶基因克隆及功能研究[D];中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院;2008年

3 戴怡齡;紅豆杉中與異戊二烯代謝途徑相關(guān)的AP2類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的克隆與功能研究[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

，

本文編號(hào)：1607996