本文選題：玉米大斑病菌　切入點：6-磷酸海藻糖合成酶　出處：《沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：玉米大斑病作為一種重要的玉米葉部病害,近幾年在東北地區(qū)呈流行高發(fā)態(tài)勢,對玉米的產(chǎn)量造成了重大損失。長期以來,人們對玉米大斑病菌的致病機制研究不夠深入,限制了新型防治技術(shù)的開發(fā),深入探索玉米大斑病致病機制對防治其發(fā)生及流行有重要意義。6-磷酸海藻糖合成酶TTST(Trehalose-6-phosphate synthase 1)在稻瘟菌具有調(diào)控菌絲生長與致病力的作用,但玉米大斑病菌StTPS1基因的功能尚未報道。本研究建立了玉米大斑病菌基因敲除技術(shù)體系,采用基因敲除技術(shù)驗證StTPS1基因的功能,并闡明StTPS1基因在玉米大斑病菌生長發(fā)育中發(fā)揮的作用,進一步深入探討玉米大斑病菌致病力形成的分子機制。1.利用PCR擴增方法克隆了玉米大斑病菌StTPS1基因。參照稻瘟菌MgTPS1氨基酸序列,采用同源比對的方法找出玉米大斑病菌中StTPS1的同源蛋白,利用PCR擴增方法成功克隆了玉米大斑病菌基因組中對應(yīng)的同源基因,并命名為StTPS1。該基因全長為2090 bp,包含四個外顯子與三個內(nèi)含子,兩端具有非翻譯區(qū)。根據(jù)該基因編碼蛋白質(zhì)的序列與稻瘟菌中MgTPS1基因編碼蛋白質(zhì)的序列之間的高度同源性,可以確定該基可能為玉米大斑病菌中的6-磷酸海藻糖合成酶StTPS1基因。2.采用多種生物信息學(xué)分析方法對StTPS1基因編碼蛋白質(zhì)進行了深入地分析,明確了其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)等相關(guān)信息。分析結(jié)果表明:該基因編碼517個氨基酸、相對分子質(zhì)量為58376.29、理論等電點為5.36并且屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)與親水性蛋白質(zhì)。軟件分析表明該基因編碼蛋白質(zhì)中不含有信號肽與跨膜結(jié)構(gòu),亞細胞定位預(yù)測結(jié)果分析此蛋白定位于細胞質(zhì),含有可被磷酸化的位點暗示該蛋白可被激酶磷酸化發(fā)揮作用,不存在糖基化位點。結(jié)構(gòu)域分析表明,該蛋白含有糖苷水解酶家族的結(jié)構(gòu)域,這與稻瘟菌MgTPS1的分析結(jié)果相似。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示,玉米大斑病菌分類地位與稻瘟菌較為接近,表明兩者的同源性較高,進化關(guān)系較近。因此,推斷StTPS1基因與稻瘟菌中TPS1基因功能相似,可能具有代謝調(diào)控與引起致病力的作用。3.對玉米大斑病菌StTPS1基因敲除載體進行構(gòu)建。以pBlueScript克隆載體為基礎(chǔ),將pSilent-1載體中的潮霉素抗性基因經(jīng)PCR擴增、HindⅢSmaI雙酶切后再連接至pBlueScript載體中獲得基因敲除骨架載體pBS-HPH。使用高保真酶擴增StTPS1基因上游片段1125 bp和下游片段895 bp分別克隆至基因敲除骨架載體pBS-HPH中,成功構(gòu)建StTPS1基因敲除載體pBS-StTSS1。4.建立了玉米大斑病菌的遺傳化體系和基因敲除體系,獲得了疑似玉米大斑病菌StTPS1基因敲除突變體。通過對玉米大斑病菌產(chǎn)孢條件優(yōu)化,確定了玉米大斑病菌在燕麥瓊脂培養(yǎng)基和V8蔬菜汁固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)、23℃全黑暗條件下培養(yǎng)14 d時產(chǎn)孢量較多。驗證出兩種分生孢子的收集的最適方法分別為:吸頭刮取方法和震蕩培養(yǎng)基法。確定了溶壁酶、崩潰酶和蝸牛酶三種酶在酶解時的比例為1:1:1,在28℃ 80rpm下酶解時間為3至5 h時可釋放原生質(zhì)體數(shù)量達到最大。進一步優(yōu)化了轉(zhuǎn)化方法,經(jīng)過多次的實驗獲得疑似玉米大斑病菌StTPS1基因敲除突變體。在進一步驗證敲除菌株的準(zhǔn)確性及其致病力的變化。5.對玉米大斑病侵染過程中玉米抗性的響應(yīng)進行了研究。接種玉米大斑病菌菌株SYY1303至感病玉米品種黃早四后,在多個時間點采集葉片,利用前人報道的方法對四種防御關(guān)鍵酶的活性進行了分析。結(jié)果證實,接種后防御酶的活性均顯著上升,但苯丙氨酸解氨酶的活性是先下降而后上升,與其它種類植物受到病原菌侵染后自身防御酶活性變化的趨勢相一致。
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【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S435.131.4

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本文編號：1587911