本文選題：甲狀旁腺激素　切入點(diǎn)：間充質(zhì)干細(xì)胞　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：甲狀旁腺功能減退是指具有生物活性的甲狀旁腺素(parathyroid hormone,PTH)分泌不足,或者不能使靶器官產(chǎn)生生理效應(yīng),其特點(diǎn)是血鈣降低,血磷增高,血中PTH減少或測(cè)不出,并表現(xiàn)出神經(jīng)肌肉興奮性增加的臨床癥狀。多數(shù)甲狀旁腺功能減退為繼發(fā)性,主要發(fā)生在甲狀腺或甲狀旁腺手術(shù)后,由于術(shù)中誤傷或切除甲狀旁腺所致。甲狀旁腺功能減退的臨床癥狀主要取決于血鈣降低的程度與持續(xù)時(shí)間及下降的速度。主要的臨床表現(xiàn)包括指端或嘴周麻木或刺痛,手足與面部肌肉痙攣,繼之出現(xiàn)手足搐搦(血清鈣一般在2mmol/L以下),有些患者可出現(xiàn)癲癇樣神經(jīng)癥狀,嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量。本課題通過(guò)基因工程方法制備表達(dá)PTH的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,觀察其對(duì)甲狀旁腺功能減退的治療作用,探索細(xì)胞治療甲狀旁腺功能減退的新途徑。一、大鼠甲狀旁腺功能減退模型的建立目的:建立SD大鼠甲狀旁腺功能減退的模型。方法:應(yīng)用納米炭負(fù)顯影技術(shù)于術(shù)中顯示甲狀旁腺,行甲狀旁腺切除術(shù),切除標(biāo)本行光學(xué)相干斷層掃描(OCT)及病理染色,記錄術(shù)后一般情況改變,評(píng)估血清鈣及PTH變化情況。結(jié)果:納米炭負(fù)顯影可于術(shù)中清楚辨認(rèn)甲狀旁腺,切除組織經(jīng)OCT成像及病理染色分析證實(shí)為甲狀旁腺組織。術(shù)后第1,5,10天,實(shí)驗(yàn)組血鈣分別為1.79±0.09,1.63±0.07,1.61±0.13 mmol/L,血PTH水平分別為13.16±3.02,15.24±4.46,15.91±5.76 ng/L,均顯著低于對(duì)照組(P0.05)。二、基因工程方法制備表達(dá)PTH的間充質(zhì)干細(xì)胞的研究目的:構(gòu)建突變型PTH慢病毒載體,用純化濃縮后的慢病毒顆粒感染大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),從而獲得表達(dá)PTH的MSCs。方法:用DNA聚合酶將前甲狀旁腺激素原(prepro PTH)基因連接入慢病毒載體質(zhì)粒,PCR定點(diǎn)突變法突變出Furin酶切位點(diǎn),載體構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收獲慢病毒顆粒并進(jìn)行純化、濃縮;采用Ⅰ型膠原酶消化大鼠脂肪組織,獲得大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ASCs),定向誘導(dǎo)分化鑒定;用慢病毒對(duì)大鼠MSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo),檢測(cè)感染后MSCs培養(yǎng)上清液中PTH的表達(dá)量。結(jié)果:成功從脂肪組織中分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞;表達(dá)PTH的慢病毒經(jīng)濃縮后,滴度達(dá)到2.5×107TU/ml,可以成功感染間充質(zhì)干細(xì)胞,感染后上清中PTH濃度達(dá)到44.09±2.33 pg/ml。三、間充質(zhì)干細(xì)胞基因治療甲狀旁腺功能減退的實(shí)驗(yàn)研究目的:觀察表達(dá)PTH的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠甲狀旁腺功能減退的治療作用。方法:運(yùn)用納米炭輔助建立大鼠甲狀旁腺功能減退模型,術(shù)后立即給予皮下注射表達(dá)PTH的間充質(zhì)干細(xì)胞(PTH-MSCs),并與注射未經(jīng)修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)及注射生理鹽水(NS)的大鼠進(jìn)行比較;觀察不同組大鼠一般情況變化及生存率改變;檢測(cè)三組大鼠術(shù)后血鈣及血PTH變化情況;采用RT-PCR法檢測(cè)術(shù)后m PTH基因體內(nèi)表達(dá)情況。結(jié)果:PTH-MSCs治療組大鼠術(shù)后精神良好,無(wú)大鼠出現(xiàn)抽搐現(xiàn)象,術(shù)后5 d、10 d血鈣分別為2.05±0.07,2.01±0.20 mmol/L,血PTH分別為23.30±5.11,25.41±6.86 ng/L,均顯著高于MSCs組和NS組(P0.05),至術(shù)后30天內(nèi)只有一只大鼠死亡;MSCs組及NS組大鼠術(shù)后精神萎靡,分別有4例(4/6)和3例(3/6)出現(xiàn)抽搐,在觀察期內(nèi)全部死亡。結(jié)論:將人prepro-PTH基因信號(hào)肽突變出Furin蛋白酶酶切位點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)有活性的PTH在間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá);納米炭混懸液可于術(shù)中輔助識(shí)別甲狀旁腺,并用于建立大鼠甲狀旁腺功能減退模型;表達(dá)PTH的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞皮下移植對(duì)甲狀旁腺功能減退有治療作用,可能成為甲狀旁腺功能減退傳統(tǒng)療法外的一個(gè)新的治療途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R582.2

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本文編號(hào)：1572392