本文選題：糖基轉(zhuǎn)移酶　切入點(diǎn)：UGT72B1　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：細(xì)胞的木質(zhì)化主要是木質(zhì)素在細(xì)胞壁內(nèi)沉淀的過程。正常情況下,該過程主要發(fā)生于維管束的次生木質(zhì)部,進(jìn)而增加木質(zhì)部細(xì)胞壁硬度和機(jī)械支撐力。木質(zhì)素的累積還能增強(qiáng)植物體長(zhǎng)距離水分運(yùn)輸能力以及抵御機(jī)械損傷和病原菌微生物的侵害等。細(xì)胞木質(zhì)化的生理學(xué)過程既是一個(gè)代謝問題,又是一個(gè)發(fā)育問題。由于調(diào)節(jié)細(xì)胞木質(zhì)化的基因數(shù)量眾多,機(jī)制復(fù)雜,目前了解很少。因此,深入研究細(xì)胞木質(zhì)化的調(diào)控機(jī)理,不僅對(duì)于理解植物生長(zhǎng)發(fā)育的規(guī)律有重要的科學(xué)理論意義,而且對(duì)于農(nóng)作物改良以及樹木材質(zhì)改良具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。植物體內(nèi)普遍存在木質(zhì)素單體的糖基化修飾現(xiàn)象,然而該現(xiàn)象從上個(gè)世紀(jì)六七十年代發(fā)現(xiàn)以來,一直沒有研究清楚木質(zhì)素單體糖基化是否與木質(zhì)素合成之間存在關(guān)系。為了深入理解它們之間的關(guān)系以及探索糖基化修飾在木質(zhì)素代謝以及細(xì)胞木質(zhì)化過程中的作用機(jī)制,我們圍繞糖基轉(zhuǎn)移酶UGT72B1開展了一系列的研究工作,取得了重要進(jìn)展。1. ugt72b1突變體鑒定與表型分析本研究首先篩選鑒定出了UGT72B1兩個(gè)擬南芥T-DNA插入突變體ugt72b1ko-1 (SALK_049597)和ugt72b1ko-2 (SAIL_611_E04)的純合株系,發(fā)現(xiàn)它們有相同的表型：一方面莖尖有大量花青素積累,另一方面莖尖生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。將UGT72B1基因?qū)氲酵蛔凅w后表型能完全恢復(fù)到野生型狀態(tài),說明突變體表型確實(shí)是由UGT72B1功能缺失導(dǎo)致。我們對(duì)莖段橫切面進(jìn)行木質(zhì)素特異性染色,不論是Wiesner染色還是Maule染色,結(jié)果都表明突變體出現(xiàn)了嚴(yán)重的異位木質(zhì)化和細(xì)胞壁木質(zhì)化的增強(qiáng)。木質(zhì)素含量分析表明突變體的木質(zhì)素含量比野生型顯著增加。透射電鏡觀察細(xì)胞壁厚度發(fā)現(xiàn)突變體細(xì)胞壁厚度明顯增厚。以上結(jié)果表明UGT72B1參與了細(xì)胞壁的木質(zhì)化過程,它的功能缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁異位木質(zhì)化和增強(qiáng)的木質(zhì)化,并影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。2. UGT72B1底物篩選及生化分析鑒定構(gòu)建了UGT72B1的原核表達(dá)載體,經(jīng)表達(dá)和純化獲得了重組蛋白,利用體外酶促反應(yīng)并借助HPLC-MS技術(shù),我們對(duì)激素類物質(zhì)如生長(zhǎng)素和赤霉素等以及苯丙烷類物質(zhì)如木質(zhì)素前體和黃酮類物質(zhì)等進(jìn)行了篩選,鑒定出這個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶能夠糖基化松柏醇、二氫松柏醇、對(duì)羥基肉桂醇和松柏醛等木質(zhì)素前體。同時(shí)我們檢測(cè)i7GT72B1高表達(dá)體內(nèi)松柏苷含量,發(fā)現(xiàn)明顯高于野生型和恢復(fù)系。對(duì)UGT72B1酶促動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定,發(fā)現(xiàn)UGT72B1對(duì)松柏醇的活性最高,比酶活為6.6 nkat/mg, Kcat/Km為0.74 mM-1s-1,高于對(duì)松柏醛的催化效率(3.1 nkat/mg和0.30 mmM-1S-1)。同時(shí)我們也對(duì)UGT72B1的同源基因UGT72B2和UGT72B3進(jìn)行了原核表達(dá)的蛋白純化和底物篩選,發(fā)現(xiàn)UGT72B3能夠糖基化芥子醛和松柏醛,但沒有發(fā)現(xiàn)UGT72B2對(duì)木質(zhì)素前體的酶活性。將UGT72B2和iJGT72B3在ugt72bl突變體內(nèi)組成型過表達(dá),發(fā)現(xiàn)UGT72B3能夠恢復(fù)ugt72bl的表型,而UGT72B2不能恢復(fù)。以上結(jié)果表明UGT72B1能夠糖基化木質(zhì)素前體,。同時(shí)也表明UGT72B1與UGT72B3在生化活性上有一定的相似性。3.基因的表達(dá)模式分析構(gòu)建了JGT72B1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)系統(tǒng),對(duì)GUS活性的組織化學(xué)染色表明：幼苗期,UGT72B1在莖生長(zhǎng)點(diǎn)及新生葉葉脈的連接處有較強(qiáng)表達(dá)；抽薹以后,主要在幼嫩莖尖、幼嫩莖生葉的葉脈、花序柄以及花瓣的維管組織中表達(dá)。從莖的橫切面染色來看,UGT72B1在幼嫩莖的各個(gè)組織都有表達(dá),如木質(zhì)部、髓部和表皮,但是在稍微老點(diǎn)的莖中只在木質(zhì)部表達(dá)。另外通過qRT-PCR也對(duì)表達(dá)模式進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示UGT72B1在各個(gè)組織的表達(dá)模式與GUS組織化學(xué)染色結(jié)果基本一致,其中主要在幼嫩的莖中表達(dá)。同時(shí)利用GUS染色和qRT-PCR技術(shù)分析了UGT72B2, UGT72B3與UGT72E2基因的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)UGT72B2主要在葉片的葉脈上表達(dá)；UGT72B3主要在葉柄的基部有較強(qiáng)表達(dá),在幼嫩葉片葉邊緣的出水孔處有很強(qiáng)的表達(dá),導(dǎo)管處也有微量表達(dá)。UGT72E2主要在苗期表達(dá),在根和莖中只有少量表達(dá)。檢測(cè)了ugt72bl突變體背景下UGT72B3與UGT72E2的表達(dá)量變化,發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)量都有所提高。以上結(jié)果表明UGT72B1表達(dá)部位正好與突變體產(chǎn)生表型的部位向吻合。幾個(gè)進(jìn)化關(guān)系很近的糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)模式各不相同,都有自己的表達(dá)部位偏好性,可能與它們發(fā)揮的主要作用相關(guān)。4.突變體轉(zhuǎn)錄組及qRT-PCR分析qRT-PCR檢測(cè)木質(zhì)素合成相關(guān)基因(包括前體合成、前體運(yùn)輸、前體聚合和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子)在突變體中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素前體合成相關(guān)基因CCR、 COMT、HCT、CAD、4CL、C4H、 CCOATOT和PAL都有明顯的上調(diào)表達(dá)；前體運(yùn)輸及聚合相關(guān)基因ABCG、RBOH、 PRX和LAC上調(diào)表達(dá)也比較明顯；木質(zhì)素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因MYB58、 MYB61、MYB63和MYB643以及NAC家族成員NST1和NST3表達(dá)量也顯著上調(diào)。另外我們還檢測(cè)到花青素合成通路中的DFR及黃酮合成通路中的CHS上調(diào)表達(dá)比較顯著。這些結(jié)果說明在突變體中涉及木質(zhì)素單體以及木質(zhì)素合成的整個(gè)代謝都獲得了增強(qiáng)。為了更加全面了解轉(zhuǎn)錄組的變化,對(duì)突變體進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體中共有931個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著變化,其中有705個(gè)上調(diào)顯著,226個(gè)下調(diào)顯著。差異表達(dá)的基因主要集中在苯丙烷代謝途徑、黃酮合成途徑、植物病原體互作途徑、淀粉和糖代謝途徑、以及苯丙氨酸代謝途徑。但是只有苯丙烷-木質(zhì)素代謝途徑中幾乎每一步的基因都顯示上調(diào)表達(dá),這與qRT-PCR分析的結(jié)果是一致的。以上結(jié)果表明突變體中UGT72B1的功能缺失激活了苯丙烷-木質(zhì)素合成途徑上的相關(guān)基因,甚至苯丙烷代謝分支途徑里的基因也被激活,結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞壁嚴(yán)重的異位木質(zhì)耗和木質(zhì)化程度的增強(qiáng),并且伴有花青素積累和莖生長(zhǎng)發(fā)育受阻�？傊�,本論文的結(jié)果不僅增加了對(duì)植物糖基轉(zhuǎn)移酶家族的功能理解,而且首次證明木質(zhì)素單體的糖基化修飾參與調(diào)節(jié)細(xì)胞壁木質(zhì)素的合成過程,回答了近半個(gè)世紀(jì)以來懸而未決的科學(xué)問題,為研究糖基化修飾在木質(zhì)素代謝以及細(xì)胞木質(zhì)化過程中的作用機(jī)制提供了重要的突破口,為深入而且全面理解木質(zhì)素合成以及細(xì)胞壁木質(zhì)化的分子機(jī)制奠定了新的理論基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 Jun Shigeto;Yoshitaka Itoh;Sakie Hirao;Kaori Ohira;Koki Fujita;Yuji Tsutsumi;;Simultaneously disrupting AtPrx2,AtPrx25 and AtPrx71 alters lignin content and structure in Arabidopsis stem[J];Journal of Integrative Plant Biology;2015年04期

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本文編號(hào)：1557931