本文關鍵詞： 旋毛蟲 豬 重組蛋白 體液免疫 細胞免疫 巨噬細胞 中性粒細胞　出處：《吉林大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：旋毛蟲是一種雌雄異體的線蟲,可感染所有的哺乳動物(包括人類)、一些食肉鳥類和爬行動物。豬是旋毛蟲感染的最重要的宿主之一,人感染旋毛蟲的報道中很大比例是由于患者曾食用了感染有旋毛蟲肌幼蟲的生的或未完全熟的豬肉制品。因此,預防豬感染旋毛蟲意義重大。本實驗室前期實驗中利用感染旋毛蟲26天和60天的豬血清分別篩選旋毛蟲不同發(fā)育時期的cDNA文庫,得到了多條強反應原性的抗原基因,并初步研究了這些基因在小鼠旋毛蟲感染模型中的免疫保護性。本實驗根據(jù)上述研究結果選取了5條(Ts-zh68、Ts-clp、Ts-T668、Ts-serpin和Ts-p45)在小鼠模型中表現(xiàn)出抗旋毛蟲保護性且疑似參與旋毛蟲存活、寄生或免疫逃避的重要功能基因,另選取Ts-p43和Ts-p53這兩條被報道在小鼠旋毛蟲感染模型中保護性效果突出的基因,利用長白豬作為動物模型,開展這七條抗原基因對豬的免疫保護作用的研究。從而為旋毛蟲疫苗的開發(fā)篩選高效的候選抗原和提供有價值的數(shù)據(jù)。本實驗利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)分別誘導表達帶有His標簽的上述七種重組蛋白,利用鎳柱進行親和層析純化,之后經(jīng)大型垂直板SDS-PAGE電泳分離、切膠回收目的條帶,用PBS溶出膠粒中的目的蛋白,最后對蛋白進行超濾管濃縮,經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定得到高純度的目的蛋白。七種目的蛋白純化產(chǎn)物分別與旋毛蟲感染60天豬血清進行免疫印跡實驗,確認了它們的反應原性。佐劑的篩選對于重組蛋白疫苗的研發(fā)十分關鍵,弗氏佐劑是實驗研究中應用最廣泛的佐劑,但由于其本身的毒性以及對肉制品品質(zhì)的影響,限制其在動物疫苗中的臨床應用。一些新型疫苗佐劑在以旋毛蟲感染小鼠為模型的疫苗研究中表現(xiàn)突出,但鑒于這些研究中所使用抗原的多樣性,無法確定最佳佐劑。因此,本研究中以rTs-Serpin為代表性重組抗原,比較了三種不同類型的佐劑(Montanide ISA201,Montanide IMS 1313 N PR VG和弗氏完全及不完全佐劑)在以旋毛蟲感染小鼠為模型的疫苗研究中的表現(xiàn),具體包括評估佐劑促進體液免疫應答和細胞免疫應答的能力。佐劑篩選實驗結果顯示,與其他兩種佐劑添加組相比,ims1313佐劑添加后的疫苗能夠誘導最好的和最持久的igg抗體,誘導igm的最高峰值要比其他兩種佐劑添加組提前兩周出現(xiàn),此外,ims1313佐劑添加組誘導小鼠血清中產(chǎn)生高水平的th1和th2型細胞因子�？傊�,結合有免疫刺激復合物的水分散性的液態(tài)納米顆粒佐劑montanideims1313nprvg,展現(xiàn)出與弗氏佐劑相當?shù)谋Ｗo性和優(yōu)于弗氏佐劑的免疫增強效果,是旋毛蟲疫苗研究可選用的理想的佐劑。且該佐劑具有無需乳化、使用方法簡便等優(yōu)點。因此,montanideims1313nprvg被選用為后續(xù)研究中的佐劑。本研究中以長白豬為實驗動物評估以上七種重組蛋白抗旋毛蟲感染的保護性。實驗共分為10個組,七個重組蛋白組、pbs組、pbs+ims1313佐劑組以及空白豬對照組,每組6頭兩月齡長白仔豬。共進行兩次免疫接種,間隔4周,每頭豬每次接種1mg重組蛋白,二免3周后各實驗組(除空白豬對照組)均灌胃感染旋毛蟲肌幼蟲(t.spiralis),每頭感染5000條肌幼蟲。攻蟲感染六周后處死實驗動物,每頭豬分別采集15個部位的肌肉,每個部位肌肉采集50g,最低不少于5g,用于消化收取旋毛蟲肌幼蟲,計算各實驗組的平均lpg(每克肌肉中的幼蟲數(shù)),以及比較各實驗組相對于pbs對照組的肌幼蟲減蟲率。實驗結果顯示,以上七種重組蛋白在旋毛蟲豬感染模型中保護性與在小鼠感染模型中存在很大差異。rts-t668、rts-clp、rts-zh68、rts-serpin、rts-p45、rts-p43和rts-p53在旋毛蟲豬感染模型中表現(xiàn)出的肌幼蟲減蟲率分別為51.31%、31.03%、45.21%、4.79%、3.66%、38.92%和2.39%。實驗中表現(xiàn)出保護力的四種蛋白中,肌幼蟲減蟲率超過40%的兩種蛋白分別來源于旋毛蟲成蟲期和新生幼蟲期,均為旋毛蟲發(fā)育早期,這提示旋毛蟲發(fā)育早期的關鍵蛋白質(zhì)分子可作為較好的旋毛蟲疫苗候選抗原。此外,研究中還采集所有實驗動物膈肌,經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片后進行he染色,觀察和比較各實驗組膈肌中旋毛蟲包囊形態(tài)變化,結果發(fā)現(xiàn)各重組蛋白免疫組的膈肌旋毛蟲包囊出現(xiàn)不同程度的形態(tài)變化,包囊周圍炎細胞侵潤的強度也存在差異,而pbs+ims1313組的旋毛蟲包囊形態(tài)和周圍炎細胞侵潤情況與pbs組相比無明顯差異。rts-t668和rts-clp組中觀察到部分旋毛蟲包囊形態(tài)變得相對其他各組更圓潤,膠原層結構無明顯變化;rts-zh68、rts-p45、rts-p53和rTs-p43中旋毛蟲包囊的膠原囊不同程度的出現(xiàn)邊緣不整齊或膠原層變薄;而rTs-serpin組旋毛蟲包囊形態(tài)完整,無明顯變化。此外,rTs-zh68、rTs-T668和rTs-p43組旋毛蟲包囊周圍炎細胞侵潤相對劇烈,提示這些組中旋毛蟲的膠原囊受損情況較嚴重。而rTs-clp、rTs-serpin、rTs-p45和rTs-p53組旋毛蟲包囊周圍炎細胞侵潤情況較輕微。為了深入理解重組蛋白的免疫保護作用,評價這七種重組蛋白抗原誘導實驗動物產(chǎn)生針對旋毛蟲的保護性免疫應答的能力。本研究評估了各實驗組重組蛋白免疫接種后體液免疫和細胞免疫應答的情況,具體包括血清中相應蛋白特異性IgG、IgG1、IgG2和IgM抗體水平變化趨勢,Th1(IFN-γ、IL-2)和Th2(IL-10、IL-4)型細胞因子水平變化,以及二免兩周后T、B淋巴細胞變化情況,旋毛蟲感染后第六天天然免疫細胞(巨噬細胞和中性粒細胞)的變化情況。結果顯示重組蛋白rTs-T668、rTs-clp和rTs-zh68免疫后均能使實驗動物在感染旋毛蟲后始終或者某一段時期內(nèi)處于Th1型免疫應答占優(yōu)勢的Th1/Th2混合免疫應答狀態(tài)。各重組蛋白組二免后兩周均能誘導Th1(IFN-γ、IL-2)和Th2(IL-10、IL-4)型細胞因子水平顯著升高(p0.05)。重組蛋白rTs-clp和rTs-p43免疫組與PBS對照組相比,巨噬細胞水平顯著升高(p0.05),均能夠消除旋毛蟲感染后(Ad6)對巨噬細胞的抑制作用。與未感染旋毛蟲的空白對照組相比,在感染旋毛蟲后(Ad6),PBS組、佐劑+PBS組、rTs-p45組和rTs-p53組中性粒細胞水平顯著下降(p0.05),這說明旋毛蟲對中性粒細胞存在顯著的免疫抑制作用,而rTs-clp和rTs-p43兩組在感染旋毛蟲后(Ad6)誘導了中性粒細胞水平略升高,雖不顯著,但提示這兩組中旋毛蟲對中性粒細胞的抑制作用被消除。綜合保護性實驗和保護性免疫應答能力評估結果,推測重組蛋白誘導產(chǎn)生的抗旋毛蟲保護性效果可能與多個保護性免疫應答因素有關,誘導Th1型占優(yōu)勢的Th1/Th2混合免疫應答,同時促進維持正常水平的天然免疫應答能力,可能是預防豬感染旋毛蟲的免疫應答的關鍵。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.7

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本文編號：1549889