本文關(guān)鍵詞： 基因敲除技術(shù) rsph3基因 左右不對稱性 prdx基因 氧脅迫　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：基因敲除技術(shù)是反向遺傳學(xué)研究的高效手段之一。CRISPR/Cas9和TALENs已經(jīng)被證實(shí)為高效的敲除工具。斑馬魚是一種可用于分析功能基因組學(xué)、研究人類疾病發(fā)病機(jī)制的優(yōu)良動物模型。纖毛病是細(xì)胞上纖毛結(jié)構(gòu)發(fā)生功能障礙所導(dǎo)致的疾病,是一種遺傳異質(zhì)性的疾病。臨床表現(xiàn)為新生兒呼吸窘迫癥、慢性呼吸道感染、支氣管擴(kuò)張、多囊腎、耳聾、內(nèi)臟倒位以及肥胖、糖尿病等。在纖毛病患者中發(fā)現(xiàn)徑向輪輻蛋白3基因(radial spoke 3 homolog,rsph3)突變類型,其纖毛9+2結(jié)構(gòu)受到破壞。RSPH3是組成徑向輪輻復(fù)合體的二十多種蛋白之一,對纖毛軸絲的滑動是必須的。本實(shí)驗(yàn)利用TALENs技術(shù)敲除斑馬魚rsph3基因,得到-8、-10、-15 bp三種F1代雜合突變體和rsph3--(-8,-15 bp)純合突變體,這些突變均產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)。原位雜交結(jié)果顯示rsph3是母源表達(dá)的基因,并在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中廣泛表達(dá)。rsph3純合突變體互交,約48%的受精卵不卵裂。在存活的突變體中,通過原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)其肝臟右移、心臟右移、心管不彎曲,顯示身體左右不對稱軸被破壞。顯微注射rsph3 mRNA可以拯救突變體肝臟右移的表型。突變體中kupffer'svesicle(KV)的標(biāo)記基因Dand5的表達(dá)模式和野生型相同,在6體節(jié)期都呈現(xiàn)不完全包圍的C形,顯示纖毛結(jié)構(gòu)的破壞未影響到KV的形態(tài)。由此推測左右對稱軸的破壞可能不是由于KV的結(jié)構(gòu)異常,而是其中纖毛結(jié)構(gòu)和功能的異常導(dǎo)致的。斑馬魚rsph3-/-突變體可以作為了解人類纖毛病的一種動物模型。過氧化物氧還蛋白(Peroxiredoxins,prdx)是細(xì)胞在清除活性氧過程中起重要作用的酶。利用CRISPR/Cas9技術(shù)對斑馬魚prdx家族進(jìn)行敲除,獲得了prdx1,prdx5,prdx6三個(gè)亞型的突變體。其中prdx1、prdx6獲得F0代突變體;prdx5得到+2、-2、-5、-8 bp四種類型F1代突變雜合體和-5 bp類型的F2代突變純合體,這些突變均產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)。原位雜交的結(jié)果顯示斑馬魚prdx1、prdx5、prdx6是母源表達(dá)的基因,并且在早期胚胎中廣泛表達(dá)。RT-PCR的結(jié)果顯示prdx1、prdx5、prdx6在成體的卵巢和精巢中有很高的表達(dá)量。其中prdx5在精巢中表達(dá)量最高。用15 mmol/L的H202處理,發(fā)現(xiàn)斑馬魚prdx5+/-胚胎耐受氧脅迫能力降低。
[Abstract]:Gene knockout is one of the most efficient methods for reverse genetic research. CRISPRR / Cas9 and TALENs have been proved to be efficient knockout tools. Zebrafish is a useful tool for analyzing functional genomes. Learn. The fine animal model to study the pathogenesis of human disease. Fibrinopathy is a disease caused by ciliated structure dysfunction on the cell, it is a disease of genetic heterogeneity. The clinical manifestation is neonatal respiratory distress. Chronic respiratory infections bronchiectasis polycystic kidney deafness visceral inversion and obesity. Diabetes mellitus and so on. The radial spoke 3 homologue rsph3) mutation type was found in patients with ciliatosis. Its ciliated 9.2 structure was destroyed. RSPH3 is one of the more than 20 proteins that make up the radial spoke complex. The TALENs technique was used to knockout the rsph3 gene of zebrafish. The heterozygous mutants of F _ 1 generation and rsph _ 3 ~ (-8) -15 BP) were homozygous. All these mutations produced truncated proteins. In situ hybridization results showed that rsph3 was a maternal expression gene and was widely expressed in zebrafish early embryonic development, and the. Rsph3 homozygous mutants intercrossed. About 48% of the fertilized eggs were not cleavage. In the surviving mutants, the liver shifted to the right, the heart shifted to the right and the cardiac tube did not bend by in situ hybridization. It shows that the dissymmetry axis of the body is broken. Microinjection of rsph3 mRNA can save the phenotype of the right shift of the mutant liver. The expression pattern of Dand5 was the same as that of wild type. At the 6 body node, the shape of C is not completely surrounded, which shows that the destruction of ciliated structure does not affect the shape of KV. It is inferred that the destruction of the left and right symmetry axis may not be due to the abnormal structure of KV. It is the abnormal structure and function of ciliates. The rsph3-r-rsph-mutants of zebrafish can be used as an animal model to understand human fiber problems. Peroxiredoxins. PRDX) is an enzyme that plays an important role in the scavenging of reactive oxygen species (Ros). The prdx family of zebrafish was knocked out by CRISPR/Cas9 technique and prdx1 / prdx5 was obtained. Among the three subtypes of prdx6, PRDX1 / prdx6 obtained F 0 generation mutants. The heterozygotes of F _ 1 generation and F _ 2 generation of -5 BP type were obtained by prdx5. All these mutations produced truncated proteins. In situ hybridization showed that the zebrafish prdx1, prdx5, prdx6 were maternal expressed genes. The results of RT-PCR showed that prdx1 and prdx5 were widely expressed in early embryos. The expression of prdx6 was high in adult ovary and testis. The highest expression of prdx5 was found in the testis and treated with H202 of 15 mmol/L. It was found that the ability of zebrafish embryos to withstand oxygen stress was decreased.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R596;Q78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周炳;趙美蓉;黃海鳳;;4種農(nóng)藥對斑馬魚胚胎的毒理研究[J];浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年02期

2 ;法國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)斑馬魚造血干細(xì)胞生成機(jī)理[J];廣西科學(xué)院學(xué)報(bào);2010年01期

3 陳粉麗;張松林;李運(yùn)彩;;斑馬魚胚胎毒理學(xué)研究進(jìn)展[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年06期

4 劉在平;張松林;;斑馬魚在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用[J];中國環(huán)境監(jiān)測;2011年04期

5 王雪;王希敏;劉可春;韓利文;袁延強(qiáng);;斑馬魚胚胎在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用[J];山東科學(xué);2011年06期

6 劉麗麗;王健;王海勝;余凱敏;李國超;閆艷春;;斑馬魚轉(zhuǎn)基因平臺的建立[J];生物技術(shù)通報(bào);2013年10期

7 朱琳,史淑潔;斑馬魚胚胎發(fā)育技術(shù)在毒性評價(jià)中的應(yīng)用[J];應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào);2002年02期

8 董武,楊景峰,王思珍,高原,解顏炯,馬國文;二VA英污染引起的特異性下頜短小—斑馬魚下頜形態(tài)學(xué)檢測[J];內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2005年03期

9 蔡翔,王捷,王穎;應(yīng)用胚胎檢測技術(shù)評價(jià)氟嗎啉對斑馬魚胚胎-幼體發(fā)育的影響[J];農(nóng)藥;2005年06期

10 張立鳳;鐘濤;桂永浩;;外源性視黃酸對斑馬魚心血管系統(tǒng)發(fā)育的影響[J];中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào);2006年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 馬雯雯;杭曉明;王巍;劉聰;孫野青;;模擬微重力影響斑馬魚胚胎發(fā)育的蛋白質(zhì)組特征[A];“基因、進(jìn)化與生理功能多樣性”海內(nèi)外學(xué)術(shù)研討會暨中國生理學(xué)會第七屆比較生理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2009年

2 張利軍;史慧勤;彭雙清;;基于斑馬魚模式動物的阿霉素心臟毒性作用研究[A];2010年全國藥物毒理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2010年

3 王晗;;斑馬魚生物鐘調(diào)節(jié)的分子遺傳和基因組機(jī)制[A];2011年全國時(shí)間生物醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

4 林秀坤;;斑馬魚作為抗腫瘤藥物模型的分子基礎(chǔ)[A];第四屆中國腫瘤大會中國藥理學(xué)會腫瘤藥理專業(yè)委員會分會場學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2006年

5 侯佳;桂永浩;張立鳳;王躍祥;宋后燕;鐘濤;;視黃酸缺乏對斑馬魚胚胎心臟發(fā)育的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第五次全國兒科中青年學(xué)術(shù)交流大會論文匯編（上冊）[C];2008年

6 陳錫強(qiáng);韓利文;王希敏;王思鋒;侯海榮;劉可春;;促滲劑氮酮對斑馬魚胚胎的透皮作用及其毒性影響(英文)[A];2012年中國藥學(xué)大會暨第十二屆中國藥師周論文集[C];2012年

7 于永利;楊景峰;王思珍;董武;;高殘留農(nóng)藥福美雙對斑馬魚胚胎體節(jié)以及脊索的影響[A];持久性有機(jī)污染物論壇2010暨第五屆持久性有機(jī)污染物全國學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

8 巴雅斯胡;楊景峰;于永利;王思珍;董武;;高殘留農(nóng)藥代森鋅誘導(dǎo)斑馬魚胚胎脊索變形[A];持久性有機(jī)污染物論壇2011暨第六屆持久性有機(jī)污染物全國學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2011年

9 張利軍;郭家彬;苑曉燕;史慧勤;趙君;束玉磊;彭雙清;;應(yīng)用斑馬魚胚胎和幼魚評價(jià)布洛芬的心臟毒性[A];2013年（第三屆）中國藥物毒理學(xué)年會暨藥物非臨床安全性評價(jià)研究論壇論文摘要[C];2013年

10 朱小山;朱琳;李燕;端正花;;富勒烯(C_(60))對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的初步研究[A];第三屆全國環(huán)境化學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2005年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前8條

1 劉妍;美國培育出終生透明的斑馬魚[N];中國漁業(yè)報(bào);2008年

2 本報(bào)記者 滕繼濮;小小斑馬魚 大大有用處[N];科技日報(bào);2010年

3 楓葉　編譯;篩選藥物：斑馬魚責(zé)任重大[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2012年

4 記者 熊琳暉 通訊員 孫慧;研究斑馬魚揭示器官再生之謎[N];長江日報(bào);2013年

5 羅剛 李兵;斑馬魚破譯人類基因的先鋒[N];健康報(bào);2004年

6 記者 李學(xué)梅;斑馬魚為治療白血病提新思路[N];新華每日電訊;2010年

7 本報(bào)記者 許琦敏;靜候那一點(diǎn)流星似的光亮[N];文匯報(bào);2012年

8 本報(bào)記者 許琦敏;劉廷析 “掘?qū)殹卑唏R魚世界[N];文匯報(bào);2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 管翊閎;核仁因子Def磷酸化修飾調(diào)控細(xì)胞周期和p53降解的研究[D];浙江大學(xué);2015年

2 胡晶瑩;環(huán)境雌激素影響斑馬魚生殖系統(tǒng)發(fā)育機(jī)制的初步研究[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

3 趙婷;Karsch-Neugebauer綜合征斑馬魚模型的建立和行為學(xué)觀察[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

4 王健;新型斑馬魚模型在研究腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移和血管侵襲機(jī)制中的應(yīng)用[D];山東大學(xué);2015年

5 王明勇;斑馬魚生物鐘基因per2突變體的構(gòu)建及在生物鐘系統(tǒng)中的功能分析[D];蘇州大學(xué);2014年

6 龔璐;p53及其異構(gòu)體△133p53/△113p53在人類細(xì)胞和斑馬魚中的功能及生物學(xué)意義研究[D];浙江大學(xué);2015年

7 郭翠翠;斑馬魚D3b基因結(jié)構(gòu)及其在胚胎發(fā)育中的作用研究[D];上海交通大學(xué);2014年

8 沈兵;致癌染料的生理毒性及分子機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2015年

9 張慶友;斑馬魚Mil/s1pr2和vmhc基因的功能研究及藥源性心臟毒性模型的建立[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

10 楊梅;乙草胺對斑馬魚的發(fā)育和生殖內(nèi)分泌干擾機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 崔俊安;稀土對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響[D];青島科技大學(xué);2011年

2 吳二社;nano-TiO_2,nano-Ag對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒理學(xué)研究[D];西北師范大學(xué);2012年

3 溫鼎聲;利用模式生物斑馬魚對化合物心臟毒性和急毒性篩選的研究[D];華南理工大學(xué);2012年

4 梁榮朝;丙烯酰胺對斑馬魚生物余能的影響及對其肝、鰓毒性的作用[D];哈爾濱商業(yè)大學(xué);2013年

5 海洋;魚藤素對斑馬魚胚胎CyclinD1的表達(dá)調(diào)控及相關(guān)抗腫瘤機(jī)制研究[D];華南理工大學(xué);2015年

6 蔣宇霞;東江流域沉積物生物毒性及其沉積物質(zhì)量綜合評價(jià)[D];中國科學(xué)院研究生院(廣州地球化學(xué)研究所);2015年

7 袁忠月;殼聚糖納米載體對神經(jīng)系統(tǒng)影響的研究[D];浙江大學(xué);2015年

8 余凱敏;毒死蜱對斑馬魚胚胎的毒性機(jī)制研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

9 羅茜;斑馬魚生長抑素-1基因靶向敲降和營救以及基于表達(dá)譜的胚胎發(fā)育功能分析[D];西南大學(xué);2015年

10 胡月陽;UBE2C基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

，

本文編號：1482420