發(fā)布時(shí)間：2018-01-30 00:29

  本文關(guān)鍵詞： 山羊痘病毒 P32蛋白 原核表達(dá) 病毒分離 KLP2基因 基因缺失　出處：《塔里木大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：羊痘是由羊痘病毒(Capripoxvirus,CaPV)引起的病毒性中最嚴(yán)重的一種,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定羊痘為必須通報(bào)疫情的重大動(dòng)物疫病之一,我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疾病。羊群的感染率和致死率均很高,嚴(yán)重影響?zhàn)B羊業(yè)的發(fā)展。2010年,新疆南疆多地暴發(fā)羊痘,造成約1.5萬(wàn)只羊只死亡,致病率和病死率分別為34%和65%。本論文對(duì)此次疫情及病原特性進(jìn)行了初步研究。首先,制備了胎羊皮膚原代細(xì)胞分離病毒。(1)胎羊皮膚原代細(xì)胞的制備:從本地牛羊屠宰場(chǎng)采取健康母羊的胎羊,分離胎羊皮膚,經(jīng)充分剪碎、清洗、消化等步驟后分散細(xì)胞,加入含10%FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液,在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)制備原代細(xì)胞,并連續(xù)傳代對(duì)胎羊皮膚細(xì)胞的培養(yǎng)特性進(jìn)行了研究。(2)病毒的分離培養(yǎng):取2010年羊痘疫情中采集的病羊皮膚,剪碎研磨后取勻漿上清接到胎羊皮膚細(xì)胞中,加雙抗(青霉素、鏈霉素),37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中,加2%FBS的DMEM培養(yǎng),觀察出現(xiàn)明顯的CPE后凍融收毒,并繼續(xù)盲傳6代,再逐代提取病毒基因組后用PCR檢測(cè)。其次,進(jìn)行了山羊痘病毒P32蛋白的表達(dá):P32蛋白是羊痘病毒的膜蛋白。為了研究新疆南疆分離的山羊痘病毒P32基因的特征,通過(guò)PCR擴(kuò)增得到P32基因全長(zhǎng)、膜外區(qū)P32mw以及親水區(qū)P3228-20,構(gòu)建了表達(dá)載體pET42b-P32、pET42b-P32mw以及pET28a為載體的pET28a-P32-20并進(jìn)行原核表達(dá),并對(duì)其核苷酸序列的同源性和遺傳進(jìn)化關(guān)系,及其推測(cè)的氨基酸序列、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。再次,構(gòu)建山羊痘病毒KLP2基因缺失表達(dá)載體。首先克隆兩端帶側(cè)翼序列的全長(zhǎng)2300bp的KLP2基因于pGEM-T載體中,用Hind III酶切除去KLP2中約1000bp的基因片段,然后將以融合PCR擴(kuò)增的VV-7.5為啟動(dòng)子和GFP報(bào)告基因的融合基因片段插入以上Hind III酶切的載體中,得到重組缺失轉(zhuǎn)移載體PGEM-KLP2-VV7.5-GFP。結(jié)果顯示:(1)胎羊皮膚細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),初期呈三角形或梭形,隨著細(xì)胞密度的增加,逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形緊密排列。前期細(xì)胞生長(zhǎng)良好,細(xì)胞界限清晰整潔,4天左右可以傳代一次。從第七代開(kāi)始,細(xì)胞生長(zhǎng)周期變短,較易脫落,有死細(xì)胞漂浮。3天甚至2天即需傳代。本研究傳代至第13代,雖然還可以生長(zhǎng),但大量的死細(xì)胞脫落導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)一步研究。(2)接種羊痘后,48h開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變,96h達(dá)到90%,病毒CPE為細(xì)胞變細(xì)長(zhǎng),細(xì)胞間隙變大,或部分細(xì)胞濃縮變圓。所有傳代病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物基因組,用P32引物檢測(cè),其結(jié)果均為陽(yáng)性。(3)山羊痘病毒P32基因的測(cè)序結(jié)果可看出:山羊痘病毒南疆株P(guān)32基因發(fā)生了較大的突變,相對(duì)對(duì)照在第100-105位增加了6個(gè)核苷酸,編碼K、N兩個(gè)氨基酸,與Gansu2009株相似�？缒し治鲲@示P32蛋白膜外區(qū)為1-282aa,跨膜區(qū)283-305aa,膜內(nèi)區(qū)為306-324aa。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其分子兩端呈現(xiàn)明顯的疏水結(jié)構(gòu),抗原性較弱,而中間區(qū)域有較強(qiáng)的親水性和較強(qiáng)的抗原性。蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)其全長(zhǎng)在大腸桿菌中幾乎沒(méi)有表達(dá),其膜外區(qū)可以包涵體形式進(jìn)行表達(dá),但表達(dá)量較低,難以純化。(4)構(gòu)建出山羊痘病毒KLP2基因缺失表達(dá)載體后,培養(yǎng)BHK-21傳代細(xì)胞,將重組缺失質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入BHK-21細(xì)胞中,可觀察看見(jiàn)細(xì)胞中表達(dá)的綠色熒光,說(shuō)明本研究成功構(gòu)建了KLP2基因缺失表達(dá)載體。本文通過(guò)研究揭示了山羊痘病毒南疆株基因構(gòu)成的特點(diǎn)和蛋白表達(dá)的情況,為深入了解P32蛋白,進(jìn)一步研究山羊痘病毒及羊痘病毒基因工程亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。并且山羊痘病毒KLP2基因缺失表達(dá)載體的構(gòu)建工作的完成也為KLP2基因缺失疫苗的研究提供了很重要的幫助。
[Abstract]:In 2010 , the infection rate and death rate of sheep skin were high and the morbidity and mortality rate were 34 % and 65 % respectively . In order to study the characteristics of P32 gene of goat pox virus isolated in southern Xinjiang , the expression vector pET42b - P32 , pET42b - P32mw and pET28a as carrier were cloned into the vector . The expression vector pET42b - P32 , pET42b - P32mw and pET28a were inserted into the vector pET28a - P32 - 20 . The results showed that the whole length of goat pox virus strain P32 gene was 1 - 282aa , the transmembrane region 283 - 305aa , the inner region of the membrane was 306 - 324aa .

【學(xué)位授予單位】：塔里木大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1474777