本文關(guān)鍵詞： 犬流感病毒 NP蛋白 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) 間接ELISA　出處：《中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)》2017年06期 　論文類(lèi)型：期刊論文

【摘要】：旨在利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)犬流感病毒(CIV)核蛋白(NP),并以此作為抗原建立檢測(cè)CIV抗體的間接ELISA方法。從CIV感染的MDCK細(xì)胞中提取總RNA,用RT-PCR法擴(kuò)增NP基因,連接到pFastBacHTA載體上,轉(zhuǎn)化含Bacmid的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,獲得穿梭質(zhì)粒NP-DH10,穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf-9昆蟲(chóng)細(xì)胞,獲得重組病毒P1-NP。病毒傳至第3代后,用Western-blot及IFA鑒定昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的蛋白與兔抗犬流感病毒NP蛋白多克隆抗體及鼠抗CIV血清發(fā)生特異性反應(yīng)。NP蛋白純化后作為抗原,建立檢測(cè)CIV抗體的間接ELISA方法。優(yōu)化后確定蛋白最佳包被濃度為2 g/mL,血清最佳稀釋度為1∶100。用建立的間接ELISA方法和血凝抑制(HI)同時(shí)檢測(cè)136份血清樣品,ELISA法檢出129份陽(yáng)性,檢出率為94.85%;HI檢出120份陽(yáng)性,檢出率為88.23%,二者符合率為93.38%,ELISA檢測(cè)方法的陽(yáng)性率高于血凝抑制。結(jié)果表明,利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的NP蛋白做為抗原,建立的檢測(cè)CIV抗體的間接ELISA方法特異性好,重復(fù)性高,可用于犬流感的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
[Abstract]:The aim of this study was to express the nucleoprotein (NPP) of Canine Influenza virus (CIV) using insect cells. It was used as antigen to establish an indirect ELISA method for detection of CIV antibody. Total RNAs were extracted from MDCK cells infected with CIV and NP gene was amplified by RT-PCR method. The shuttle plasmid NP-DH10 was obtained by ligation to pFastBacHTA vector and transformed into DH10Bac receptive cells containing Bacmid. The shuttle plasmid was transfected into sf-9 insect cells. The recombinant virus P1-NP.The virus was transferred to the third generation. Western-blot and IFA were used to identify the specific reaction between the expressed protein of insect cells and rabbit anti-canine influenza virus NP protein polyclonal antibody and mouse anti-#en2# serum. NP protein was purified as. Antigen. An indirect ELISA method for the detection of CIV antibody was established, and the optimal coating concentration of protein was determined to be 2 g / mL. The best dilution of serum was 1: 100. The indirect ELISA method and hemagglutination inhibition assay were used to detect the serum samples. The detection rate was 94.85; The positive rate of HI was 88.23 and the positive rate of Elisa was 93.38. The result showed that the positive rate of Elisa was higher than that of hemagglutination inhibition. Using NP protein expressed in insect cells as antigen, indirect ELISA method for detecting CIV antibody was established, which was specific and reproducible, and could be used in the diagnosis and epidemiological investigation of canine influenza.
【作者單位】： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院;江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心;
【基金】：科技部國(guó)際合作專項(xiàng)(2014DFG32770) 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0501000) 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303042) 江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目[CX(15)1065] 江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(PAPD)
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【正文快照】： 犬流感(canine influenza,CI)是由正黏病毒科A型流感病毒屬的犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)引起的一種接觸性呼吸道傳染病�；既憩F(xiàn)為發(fā)熱、流鼻涕、食欲不振、嗜睡和精神沉郁[1]。2004年在美國(guó)佛羅里達(dá)州的一只患有呼吸道癥狀的賽犬體內(nèi)首次分離到H3N8犬流感病毒,

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