本文關(guān)鍵詞：斑馬魚(yú)基因工程的研究進(jìn)展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

　遺傳學(xué)報(bào)　ActaGeneticaSinica,October2004,31(10):1167～1174ISSN0379-4172

TheResearchProgressofZebrafishGeneEngineering

WUYu-Ping,XIONGQian,ZHANGGuang-Xian,XUAn-Long

(TheOpenLaboratoryofMarineFunctionalGenomicsofStateHigh-TechDevelopment,

CollegeofLifeSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou510275,China)

Abstract:Theresearchprogressofzebrafishgeneengineeringisreviewed,inincludingtherecentexplosionstatusoftransgeniczebrafishlines,transgeneiczebrafishintargetedscreens,thedevelopmentoftransgenictechnologyinze-brafishaswellasthecurrenthotspotsandfutureperspectiveofzebrafishgeneengineering.Bynowthezebrafishgeneengineering,nucleartransplantationandchromosomesetmanipulationtechnologieshavebeenestablishedinChina.Withfirmfoundationofzebrafishcytogeneticsandembryology,wewillobtaingeneengineeringzebrafishwithgenetar-getingintegrationandpromotetheadvancementanddevelopmentofbiotechnologyinappliedresearchfieldinnearfu-ture.

Keywords:zebrafish;geneengineering

斑馬魚(yú)基因工程的研究進(jìn)展

吳玉萍,熊　茜,張廣獻(xiàn),徐安龍

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,國(guó)家“863”計(jì)劃海洋生物功能基因組開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,廣州　510275)

摘　要:對(duì)國(guó)內(nèi)外斑馬魚(yú)基因工程研究進(jìn)展,包括最近獲得的大批轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系、靶向篩選的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)、斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和斑馬魚(yú)基因工程的熱點(diǎn)問(wèn)題與應(yīng)用前景進(jìn)行了綜述。指出我國(guó)已建立日趨成熟的斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因技術(shù)、細(xì)胞核移植技術(shù)和染色體組操作技術(shù),具有斑馬魚(yú)細(xì)胞遺傳學(xué)和胚胎學(xué)基礎(chǔ),我國(guó)有望在不久的將來(lái)獲得定向整合的基因工程斑馬魚(yú),并推動(dòng)生物技術(shù)應(yīng)用研究領(lǐng)域的進(jìn)步和發(fā)展。關(guān)鍵詞:斑馬魚(yú);基因工程

中圖分類(lèi)號(hào):Q341　　　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A　　　文章編號(hào):0379-4172(2004)10-1167-08

　　20世紀(jì)90年代開(kāi)始啟動(dòng)的“人類(lèi)基因組計(jì)劃”(HGP)重點(diǎn)內(nèi)容之一是對(duì)模式生物的研究。具備脊椎動(dòng)物分子發(fā)育生物學(xué)和人類(lèi)基因組計(jì)劃模式種條件的斑馬魚(yú),由于其易于進(jìn)行細(xì)胞譜系分析并兼具酵母、線蟲(chóng)、果蠅和小鼠式遺傳的特征而日益受到學(xué)者的關(guān)注。1981年,Streisinger[1]在《Nature》上發(fā)

表了關(guān)于斑馬魚(yú)克隆系的研究,隨后它的基因連鎖圖的構(gòu)建成為突變基因克隆的開(kāi)端[2]。

1　斑馬魚(yú)基因工程研究概況

斑馬魚(yú)的轉(zhuǎn)基因研究始于1988年[3,4],此后進(jìn)

收稿日期:2003-10-17;修回日期:2004-02-13

基金項(xiàng)目:國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):2002AA629010)、國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):30371113)、廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):2003C20303)和珠海

市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):PC200310043)資助[SupportedbytheNational“863”P(pán)roject(No.2002AA629010),ChineseNationalNaturalScienceFoundation(No.30371113),theScienceandTechnologyProjectofGuangdongProvince(No.2003C20303)andtheScienceandTechnologyProjectofZhuhaiCity(No.PC200310043)]

作者簡(jiǎn)介:吳玉萍(1963-),女,博士,副教授,研究方向:魚(yú)類(lèi)遺傳學(xué)。E-mail:exwyp@zsu.edu.cn

1168遺傳學(xué)報(bào)　ActaGeneticaSinica　Vol.31　No.10　2004

展迅速。目前,國(guó)內(nèi)外已獲得大批轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系(表1)。例如:1992年,Lin等[5]把有色斑馬魚(yú)囊胚細(xì)胞注入白化種囊胚,得到有色素細(xì)胞的嵌合體,嵌合體與白化魚(yú)交配得到有色后代;移植轉(zhuǎn)lacZ基

因囊胚細(xì)胞也得到嵌合體,轉(zhuǎn)基因性狀可以傳遞給后代。斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)分析體內(nèi)細(xì)胞間相互作

用,作為動(dòng)物模型探討發(fā)育、生長(zhǎng)、繁殖等機(jī)理,以及闡明控制脊椎動(dòng)物的發(fā)育機(jī)制等方面均具有重要意義。目前,斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞體外成熟、配子發(fā)生和受精的調(diào)控機(jī)制、胚胎干細(xì)胞的分離、基因克隆及基因敲除等研究都已成為研究熱點(diǎn)。

表1　轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系

Table1　Transgeniczebrafishlines

表達(dá)分類(lèi)Expressioncategory1無(wú)限制Unrestricted

pUSVCATRSV/lacZCMV/luciferasedHSP/CAT-NPT-BGALdHSP/HPTXenopusef1a/lacZ

PPPPP

pSV/hygro

轉(zhuǎn)植基因Transgene

載體VectorP

表達(dá)模式Expressionpattern無(wú)表達(dá)Notexpressed一批陽(yáng)性

Batchassaypositive無(wú)表達(dá)

Notexpressed無(wú)表達(dá)Notexpressed無(wú)表達(dá)Notexpressed

5個(gè)種系自普遍存在至斑駁的表達(dá)

Fivelinesrangefromubiquitoustopatch

MoMLV/lacZRSV/neoXenopusef1a/GFP

RP

無(wú)表達(dá)Notexpressed2/4可檢測(cè)表達(dá),普遍存在2/4withdetectableexpression,ubiquitous

Carpβactin/CAT

P

不均一表達(dá),限制于軸向和軸旁的中胚層

Nonuniformexpressionlimitedtoaxialandparaxialmesoderm

Xenopusef1a/lacZZebrafishβactin/GFPXenopusef1a/GFPCarpβactin/CATCarpβactin/CATXenopusef1a/GFPntdMedakaβactin/GFPZebrafishef1a/H2BGFP

RPTPP+IPP+ITRP

無(wú)表達(dá)Notexpressed普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在(定位細(xì)胞核)Ubiquitous(nuclearlocaliza-tion)

2神經(jīng)系統(tǒng)Nervoussystem

Zebrafishislet1/GFPZebrafishHuC/GFP

PP

MouseHSP/lacZ

P

7/8非表達(dá)系,1個(gè)種系表達(dá)7/8nonexpressinglines;1lineexpressing頭蓋運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元Cranialmotorneurons神經(jīng)系統(tǒng)Nervoussystem

32＊6

[20]

88241219100

＊

轉(zhuǎn)基因發(fā)生率(%)

Rateoftransgenesis

5＊7163316

參考文獻(xiàn)Reference[3][4][6][7][8][9]

167

[10][11]

7

[12]

83

[13][14][15][16][16][17][18][19]

[21][22]

WUYu-Pingetal.:TheResearchProgressofZebrafishGeneEngineering1169續(xù)表1

表達(dá)分類(lèi)Expressioncategory

轉(zhuǎn)植基因Transgene

Goldfisha1tubulin/GFPZebrafishrodopsin/GFPRatGAP43/GFPZebrafishHuC/GFPZebrafishpax2.1/lacZ

載體VectorPPPPP

表達(dá)模式Expressionpattern神經(jīng)系統(tǒng)Nervoussystem視網(wǎng)膜桿狀體光感受器Rodphotoreceptors神經(jīng)系統(tǒng)Nervoussystem神經(jīng)系統(tǒng)

Nervoussystem

MHB,后腦,脊髓等

MHB,hindbrain,spinalcordetal.

轉(zhuǎn)基因發(fā)生率(%)

Rateoftransgenesis2～54＊31009

參考文獻(xiàn)Reference[23][24][25][19][26]

ZebrafishAANAT-2/GFP

3淋巴細(xì)胞Lymphoidcell

Zebrafishrag1/GFP

PPAC

松果腺光感受器Pinealphotoreceptor

容量最大載體,在胸腺腎、嗅覺(jué)神經(jīng)元中表達(dá)

Largestconstructexpressedinthymus,kidneyandolfactoryneurons

3n.a.

[27][28]

4上皮細(xì)胞Epithelia5胰腺Pancreas6肌肉Muscle

Zebrafishkrt8/GFPZebrafishinsulin/GFPZebrafisha-actin/GFPZebrafisha-actin/GFP

PPP+ITRPP+/-NLS

上皮細(xì)胞Epithelia胰腺Pancreas肌肉Muscle

肌肉Muscle

中間細(xì)胞和循環(huán)血液Intermediatecellmassandcir-culatingblood

16n.a.6281

[29][30][18][14][31]

7血液Blood8生殖細(xì)胞Germcells9脈管系統(tǒng)Vasculature

Zebrafishgata1/GFP

Zebrafishvasa/GFPZebrafishfli1/GFP

PP

生殖細(xì)胞Germcells

脈管系統(tǒng)、主動(dòng)脈弓、頜、鰭間葉細(xì)胞

Developingvasculature,aorticarches,jaw,finmesenchyme

215

[32][33]

10熱激-誘導(dǎo)型Heatshock-inducible

Zebrafishhsp70/GFPZebrafishhsp/slit2-GFP

PP

熱激普遍存在

Ubiquitousuponheatshock熱激普遍存在

Ubiquitousuponheatshock

24

[34][35]

　　P:質(zhì)粒;P+I:具絕緣子的質(zhì)粒;P+NLS:質(zhì)粒和核定位序列多肽;T:轉(zhuǎn)座子;R:逆轉(zhuǎn)錄病毒;P+ITR:具反向末端重復(fù)的腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒;PAC:P1人工染色體;＊:基于單個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物;n.a.:信息無(wú)效;lacZ:β-半乳糖苷酶基因;CMV:巨細(xì)胞病毒;CAT:氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶;HSP:熱激啟動(dòng)子;GFP:綠色熒光蛋白;NPT:新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶;BGAL:β-半乳糖苷酶;HPT:潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶;MoMLV:莫洛尼氏剛果紅白血病毒。

P:plasmid;P+I:plasmidwithinsulatorelements;P+NLS:plasmid+nuclearlocalizationsequencepeptides;T:transposon;R:retrovirus;P+ITR:plasmidwithadeno-assoicatedvirusinvertedterminalrepeat;PAC:P1artificialchromosome;＊:basedonsingletransgenicanimal;n.a.:infor-mationnotavailable;lacZ:β-galactosidasegene;CMV:cytomegalovirus;CAT:chloramphenicolacetyltransferase;HSP:heatshockpromoter;GFP:greenfluorescentprotein;NPT:neomycinphosphotransferase;BGAL:β-galacosidase;HPT:hygromycinphospho-transferase;MoMLV:MoloneyMurineLeukemiaVirus.

　　1982年,Palmiter[36]等將大鼠生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn),“鼠”,這一突破性成果為動(dòng)物基因工程定向育種研究,

1170遺傳學(xué)報(bào)　ActaGeneticaSinica　Vol.31　No.10　2004

生物研究所朱作言領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室在世界上率先開(kāi)展了魚(yú)類(lèi)基因工程定向育種研究,建立了完整的轉(zhuǎn)基因魚(yú)理論模型和完善的實(shí)驗(yàn)技術(shù)體系,為轉(zhuǎn)基因魚(yú)育種奠定了理論基礎(chǔ)。目前,全世界有數(shù)十個(gè)

實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了魚(yú)類(lèi)基因轉(zhuǎn)移研究,建立了顯微注射、電融合及精子攜帶法等多種基因轉(zhuǎn)移方法,獲得了快速生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因鯉、大馬哈魚(yú)、虹鱒、大西洋鮭和羅非魚(yú)等,規(guī)�；B(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)也在進(jìn)行中。雖然基因工程定向育種技術(shù)已取得突破,但基因工程育種的目的還未能達(dá)到,外源基因的隨機(jī)整合、非可控表達(dá)及轉(zhuǎn)基因魚(yú)生物安全性等問(wèn)題,嚴(yán)重影響了這一基因工程育種技術(shù)在魚(yú)類(lèi)育種上的有效應(yīng)用,成為制約轉(zhuǎn)基因魚(yú)研究進(jìn)一步發(fā)展和推廣應(yīng)用的瓶頸。因此,開(kāi)辟一條基因工程育種新途徑的研究顯得十分迫切和必要。利用同源重組進(jìn)行內(nèi)源基因修飾與可控表達(dá)及基因修飾魚(yú)克隆技術(shù)的建立,對(duì)魚(yú)類(lèi)基因工程育種、生物反應(yīng)器研制以及基因功能與表達(dá)調(diào)控和發(fā)育生物學(xué)研究,都具有重大理論指導(dǎo)意義和潛在應(yīng)用價(jià)值。由于斑馬魚(yú)為模式魚(yú),其遺傳背景清楚、繁殖周期短、產(chǎn)卵過(guò)程可人為控制、懷卵量大、體外受精、胚胎透明便于觀察等,并已具有成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù),因而已成為魚(yú)類(lèi)基因工程中基因同源重組、基因表達(dá)調(diào)控和基因功能研究的理想材料。

魚(yú)類(lèi)克隆研究始于1963年,是由我國(guó)學(xué)者童第周教授等率先進(jìn)行的。20世紀(jì)70年代,中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所參與合作,克隆了第一尾鯉鯽囊胚細(xì)胞核移植魚(yú)。隨后在80年代,中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所將魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞核移植相結(jié)合,獲得第一例體細(xì)胞克隆脊椎動(dòng)物,即腎細(xì)胞核移植鯽魚(yú)。轉(zhuǎn)基因克隆魚(yú)的研究,就是把基因轉(zhuǎn)移和克隆技術(shù)結(jié)合起來(lái),應(yīng)用于魚(yú)類(lèi),建立一套快速省時(shí)的魚(yú)類(lèi)基因工程方法,為培育魚(yú)類(lèi)新品種和建立生物反應(yīng)器提供技術(shù)儲(chǔ)備。該項(xiàng)研究可以縮短培育純系轉(zhuǎn)基因魚(yú)的時(shí)間,提高目的基因整合率,具有廣泛的應(yīng)用前景。目前,模式動(dòng)物斑馬魚(yú)的細(xì)胞核移植研究已在國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室獲得成功,鑒于斑馬魚(yú)的類(lèi)胚胎干細(xì)胞研究已取得進(jìn)展,它將為斑馬魚(yú)基因組定向整合技術(shù)奠定基礎(chǔ),并有望在研究脊椎動(dòng)物發(fā)育過(guò)程的基因功能、細(xì)胞核發(fā)育潛能及核質(zhì)關(guān)系等理論問(wèn)題上發(fā)揮重要作用。

[39～41]

[37,38]

2　斑馬魚(yú)基因工程發(fā)展前景

2.1　靶向篩選的轉(zhuǎn)基因魚(yú)類(lèi)

過(guò)去大部分的研究集中在利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)進(jìn)行發(fā)育基因表達(dá)和活體形態(tài)發(fā)生等方面,今后須考慮利用熒光標(biāo)記魚(yú)來(lái)篩查突變體、小分子或抑制正常發(fā)育的毒素�；驘晒鈽�(biāo)記魚(yú)類(lèi)與反求遺傳學(xué)方法聯(lián)合起來(lái)可以分析在特殊的發(fā)育途徑中已知基因的作用規(guī)律。迄今為止,在斑馬魚(yú)中還不可能做到定點(diǎn)基因失活(targetedgenedisruption)。當(dāng)前,最常用的定點(diǎn)基因失活方法是將嗎啉代(morpholino)注射到早期的胚胎中,嗎啉代其實(shí)就是修飾的反義寡核苷酸,能夠特異消減(knock-down)基因表達(dá)[42]。然而,與用胚胎細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生種系嵌合體和用胚胎性成纖維細(xì)胞核代替合子核而產(chǎn)生克隆斑馬魚(yú)兩種技術(shù)相比,能夠產(chǎn)生真正的基因敲除魚(yú)的方法才略顯曙光[43,41]。就正常發(fā)育而言,利用組織特異和途徑特異的基因消減或基因敲除的轉(zhuǎn)基因種系可以為在活體內(nèi)觀察動(dòng)態(tài)過(guò)程提供可能性,以便理解這個(gè)基因在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育中是怎樣起作用和何時(shí)、何地起作用的。

除了篩選影響正常發(fā)育的突變以外,斑馬魚(yú)還可用于篩查阻斷特殊發(fā)育途徑的小分子。最近的研究顯示,8/1100合成的小分子對(duì)發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、耳或色素的正常形成有促進(jìn)作用[44]。除了能發(fā)現(xiàn)影響正常發(fā)育的小分子以外,還可以用表型模擬人類(lèi)疾病的魚(yú)篩選具有治療價(jià)值的小分子[45]。此外,熒光標(biāo)記魚(yú)還可提高手工篩選的通量,并且可引導(dǎo)向自動(dòng)篩選的方向發(fā)展。與此相關(guān)的生態(tài)發(fā)育生物學(xué)研究新領(lǐng)域,也將從熒光標(biāo)記魚(yú)中受益。倘若調(diào)控途徑能夠受控于活體轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú),這些魚(yú)就可以作為環(huán)境污染物的指示器而發(fā)揮重要作用[46]。據(jù)報(bào)道,有3種方法用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)檢測(cè)環(huán)境有害化學(xué)物:一種是利用攜帶了整合高拷貝數(shù)量的大腸桿菌穿梭載體的斑馬魚(yú)來(lái)測(cè)試環(huán)境誘變劑[47]。Udvadia等學(xué)者正在設(shè)計(jì)熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú),以此熒光定位的轉(zhuǎn)換(例如從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)位置)來(lái)測(cè)試誘變劑的活性,這種方法具有高通量篩選誘變劑的潛力;第二種方法利用標(biāo)記轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú),其熒光或熒光素酶受到一種啟動(dòng)調(diào)

WUYu-Pingetal.:TheResearchProgressofZebrafishGeneEngineering1171

環(huán)境污染物如芳烴、重金屬和環(huán)境雌激素的影響[46];第三種可能性是利用組織限制的熒光標(biāo)記魚(yú)來(lái)篩選對(duì)特殊發(fā)育途徑產(chǎn)生特別作用的環(huán)境毒素。綜上所述,轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)不僅可以服務(wù)于闡明自然的發(fā)育事件,而且可以用來(lái)促進(jìn)發(fā)育途徑中某些重要成分的發(fā)現(xiàn),以及評(píng)估環(huán)境對(duì)這些相同途徑的作用。

2.2　斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展

在大多數(shù)情況下,DNA顯微注射由于其相對(duì)操作簡(jiǎn)單、效果可靠,仍為斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因研究的主要方法。應(yīng)用DNA顯微注射獲得斑馬魚(yú)種系轉(zhuǎn)基因頻

[48]

率為10%～30%,而在小鼠則為10%～

帶大范圍核酸酶(meganuclease)識(shí)別位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因載體一并注入,該項(xiàng)技術(shù)可產(chǎn)生高達(dá)30%的轉(zhuǎn)基因效率、50%的種系傳遞率和單拷貝或低拷貝數(shù)量的整合事件。如果這種方法同樣在斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因

研究中也獲得成功,它將為大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室提供一種更加穩(wěn)定、高效、簡(jiǎn)捷的轉(zhuǎn)基因方法。目前,Sanger中心已完成斑馬魚(yú)基因組測(cè)序及組裝,使得我們非常方便地利用序列信息鑒定和分離感興趣基因的啟動(dòng)調(diào)控區(qū)域,序列信息還將使開(kāi)展斑馬魚(yú)同源重組技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室受益,因?yàn)樗沟脙?nèi)源基因的切割、置換和修飾成為可能。這些技術(shù),尤其是當(dāng)它們被發(fā)展為僅需要簡(jiǎn)單的DNA注射時(shí),便使斑馬魚(yú)成為分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的理想工具。2.3　斑馬魚(yú)基因工程的熱點(diǎn)問(wèn)題與應(yīng)用前景

魚(yú)類(lèi)胚胎干細(xì)胞和基因靶向操作的研究目前尚處于起步階段,盡管在斑馬魚(yú)和青鳉上已經(jīng)建立了類(lèi)ES細(xì)胞系,在青鳉上也獲得了ES細(xì)胞移植的嵌合體,但迄今為止尚未得到能傳遞給后代的種系嵌合體,而這一步對(duì)于進(jìn)行魚(yú)類(lèi)基因靶向操作是至關(guān)重要的一步。在基因靶向操作技術(shù)方面,目前已構(gòu)建了斑馬魚(yú)生長(zhǎng)激素基因同源重組載體(吳玉萍等,待發(fā)表)和青鳉p53基因同源重組載體;有學(xué)者預(yù)測(cè)魚(yú)類(lèi)基因靶向操作的研究將在斑馬魚(yú)或青鳉上首先獲得成功,隨后將向經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)推廣。2002年,Lee等[41]在國(guó)際上首次將整合外源綠色熒光蛋白(GFP)基因的斑馬魚(yú)長(zhǎng)期培養(yǎng)的胚胎細(xì)胞核移植到同種魚(yú)的去核卵中,研制出了可成活的二倍體后代。這一重大進(jìn)展為細(xì)胞核移植在魚(yú)類(lèi)基因工程育種上的應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。因此,細(xì)胞核移植和胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)及基因靶向操作技術(shù)相結(jié)合,在魚(yú)類(lèi)基因工程育種應(yīng)用上前景廣闊。

斑馬魚(yú)基因工程中的基因敲除技術(shù)可以使我們極為精確的操作單個(gè)基因,遺傳改變非常清楚,可以研究以前經(jīng)典遺傳學(xué)無(wú)法了解的基因表達(dá)效應(yīng),對(duì)于搞清每個(gè)基因的作用無(wú)疑是一個(gè)重要的里程碑。但這一技術(shù)也帶來(lái)一些難以預(yù)見(jiàn)的問(wèn)題。近來(lái)人們爭(zhēng)論的焦點(diǎn)是動(dòng)物機(jī)體是否有冗余基因,基因敲除模型的表型是否是由突變的靶基因造成的。目前,基因敲除的結(jié)果部分忽略了背景基因的作用,由于敲除基因的缺失,機(jī)體可能產(chǎn)生一種雪崩式的代償過(guò)程,引起基因的第二次改變,因此有理由相信一個(gè)[54,55]

[53]

40%。在小鼠和斑馬魚(yú)中,通常導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因多聚

體的單一整合。復(fù)雜整合事件將為染色體內(nèi)重組提供基本條件,并將導(dǎo)致表達(dá)變異。為了充分利用斑馬魚(yú)和其他脊椎動(dòng)物模型,降低整合位點(diǎn)的復(fù)雜性,減少嵌合體和提高轉(zhuǎn)基因效率,目前又發(fā)展了其他轉(zhuǎn)基因方法。

對(duì)于斑馬魚(yú),可采用擬型反轉(zhuǎn)錄病毒感染方法。早期采用反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn),沒(méi)有產(chǎn)生基因表達(dá)作用[9,13]。隨后有學(xué)者報(bào)道,整合進(jìn)入病毒載體的非病毒啟動(dòng)子或基因捕獲確認(rèn)的內(nèi)源基因啟動(dòng)子調(diào)控的報(bào)道基因可以獲得表達(dá)[48,50]。這種方法非常高效,每個(gè)轉(zhuǎn)基因奠基者平均有25個(gè)獨(dú)立分開(kāi)的單拷貝插入序列[50]。然而,反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因所需的構(gòu)建、包裝、滴定和感染是一個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)的過(guò)程,遠(yuǎn)不適應(yīng)于常規(guī)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)啟動(dòng)子或基因功能的分析。

第二種產(chǎn)生單拷貝轉(zhuǎn)基因插入序列的方法是利用轉(zhuǎn)座子操作[51,52]。相對(duì)于反轉(zhuǎn)錄病毒操作而言,轉(zhuǎn)座子具有兩大優(yōu)勢(shì):1)它可以建立更大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因體系;2)其準(zhǔn)備時(shí)間與DNA顯微注射技術(shù)相近。這種方法的主要缺陷是效率極低,整合不到位,而且質(zhì)粒DNA多聚體為隨機(jī)整合[52]。

還有一種轉(zhuǎn)基因替代方法適用于盤(pán)基網(wǎng)柄菌(Dictyostelium),是將轉(zhuǎn)染的精核注入蛙卵原核,可產(chǎn)生60%～80%轉(zhuǎn)基因胚胎。受試的F0代中100%可產(chǎn)生攜帶并表達(dá)基因的后代。盡管此種方法與DNA顯微注射相比,需要更高的技術(shù)支撐,但它在斑馬魚(yú)基因工程應(yīng)用中前景樂(lè)觀[18]。

最近,在轉(zhuǎn)基因青鳉中報(bào)道了一種更簡(jiǎn)捷的方法[49]

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