本文關(guān)鍵詞：樺褐孔菌（Inonotus obliquus LNUF008）鯊烯合酶基因工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵生產(chǎn)三萜類物質(zhì)的初步研究

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【摘要】：樺褐孔菌是一種珍貴的藥用真菌,早在16世紀(jì),東歐民間就用樺褐孔菌防治肺結(jié)核、胃腸癌和心血管類疾病,三萜化合物是樺褐孔菌藥用價(jià)值的主要活性成分,具有抗氧化、抗腫瘤和抗菌活性,鯊烯合酶(Squalene synthase, SQS)是三萜物質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵酶,其含量和活性決定了三萜化合物的產(chǎn)量。隨著野生資源的日益枯竭及對樺褐孔菌需求量的日益增加,應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)提高人工培養(yǎng)樺褐孔菌菌絲體三萜類化合物的產(chǎn)量來滿足人們對樺褐孔菌的需求尤為重要。本文以本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGAPZaA-SQS為模板,用含有Not Ⅰ和Kpn Ⅰ的引物,通過PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得了SQS cDNA序列；用含有相同酶切位點(diǎn)的引物,以絲狀真菌表達(dá)載體pAN7-1為模板,通過PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得了pAN7-1-△hph基因片段；兩片段經(jīng)T4 DNA連接酶連接,成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pAN7-1-SQS。用溶壁酶(lywallzyme)酶解樺褐孔菌的菌絲膜,成功制備了樺褐孔菌的原生質(zhì)體,篩選到了適合樺褐孔菌原生質(zhì)體再生的培養(yǎng)基。pAN7-1-SQS與含潮霉素抗性基因的載體pAN7-1經(jīng)過線性化后共轉(zhuǎn)化樺褐孔菌原生質(zhì)體,經(jīng)原生質(zhì)體再生及抗生素篩選,成功獲得了陽性菌株。以工程菌的基因組為模板,通過設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增技術(shù)驗(yàn)證了陽性菌株基因組中存在pAN7-1-SQS上的SQS cDNA序列；同時(shí),以工程菌的基因組為模板,通過設(shè)計(jì)擴(kuò)增SQS編碼區(qū)的引物,通過PCR擴(kuò)增技術(shù)驗(yàn)證了陽性菌株基因組中同時(shí)存在SQS基因序列和SQS cDNA序列,膠回收后測序,結(jié)果與理論一致,說明pAN7-1-SQS已轉(zhuǎn)入陽性菌株。對樺褐孔菌SQS基因工程菌的三萜化合物的產(chǎn)量及菌絲干重進(jìn)行初步測定,結(jié)果顯示,與野生型樺褐孔菌相比,三萜化合物產(chǎn)量提高了34%,而菌絲干重沒有明顯變化,說明工程菌生長良好。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究樺褐孔菌藥用價(jià)值及提高三萜化合物的產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：遼寧大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TQ920.1;Q78

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本文編號：1295153