本文關鍵詞：柑橘衰退病毒基因p23 RNAi載體的構建及轉化

  更多相關文章： 柑橘衰退病毒 p RNAi 大紅甜橙 瞬時表達 遺傳轉化

【摘要】：【目的】構建柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)含p23的RNAi載體,以獲得具有抗性的柑橘轉基因植株。【方法】基于轉化病毒基因介導抗性,根據(jù)NCBI公布的CTV基因組序列,查找p23保守序列,設計并克隆兩條不同長度的片段。對兩條片段和植物表達載體p BI 121進行雙酶切和連接來構建RNAi載體。初步預測所構建的載體發(fā)生RNAi抗病毒的可行性。利用農桿菌介導的瞬時表達技術將含RNAi載體的農桿菌注射入CTV指示植物墨西哥萊蒙的葉片,利用GUS組織化學染色法觀察葉片中載體發(fā)生瞬時表達的情況。發(fā)生瞬時表達的葉片接種CTV T36基因型,利用酶聯(lián)免疫反應(ELISA)檢測病毒含量。同時,提取葉片的RNA并反轉錄為c DNA,利用實時熒光定量PCR(q-PCR)檢測CTV p20,通過該基因的表達量反映葉片中的病毒含量。通過農桿菌介導的遺傳轉化將RNAi載體轉入大紅甜橙實生苗上胚軸節(jié)間莖段,抗生素篩選得到的芽嫁接至枳橙實生試管苗。提取大紅甜橙葉片的DNA,通過PCR擴增確定其是否為轉基因陽性;目的基因檢測為陽性的植株二次嫁接至溫室保存的酸橙實生苗;根據(jù)插入的p23基因序列設計q-PCR引物,檢測轉基因植株中p23的表達情況。取CTV T36基因型寄主的帶皮芽,用腹接法接種大紅甜橙轉基因植株。取接種后新萌發(fā)枝梢上的葉片,用檢測瞬時表達葉片同樣的方法分析植株的抗病性。對于第1次接種后未檢測出病毒感染的植株,進行第2次接種并檢測分析�！窘Y果】克隆得到CTV p23 513 bp的長片段和291 bp的短片段,與載體p BI121連接后成功構建含發(fā)夾結構的來自病原且能靶向目的基因的RNAi載體,命名為p23-RNAi。注射p23-RNAi的墨西哥萊蒙葉片經GUS染色后能夠產生藍色斑點,表明農桿菌p23-RNAi可以在葉片中發(fā)生瞬時表達;接種CTV后第15和30天,瞬時表達p23-RNAi的墨西哥萊蒙葉片ELISA檢測結果均為陰性,同時q-PCR檢測結果顯示其CTV p20的積累水平和增加速度明顯低于對照植株,表明瞬時表達的p23-RNAi在一定時間內可以對CTV的侵染產生抑制。p23-RNAi經農桿菌介導遺傳轉化大紅甜橙獲得抗性芽,通過普通PCR的擴增結果證明得到7個轉基因植株;q-PCR檢測結果進一步表明7個轉基因植株間p23的含量呈現(xiàn)一定差異,植株E的含量最高,其次是C、F、H、A、B和G。接種CTV后,p20的表達量在7個轉基因植株間也表現(xiàn)出一定差異,表達量最高的是植株A,其次是G、F、E、B、H、C,且與對照植株相比,呈現(xiàn)不同程度的抗病性。轉基因植株對病毒的抗性與外源基因的表達水平沒有相關性,外源基因表達水平最高的植株E并沒有表現(xiàn)強的CTV抗性。經過兩次病毒接種,轉基因植株C在接種后具有完全抗性。【結論】p23-RNAi載體能引起植物抗柑橘衰退病毒;瞬時表達技術可快速鑒定RNAi載體的抗病性,有利于篩選高效率的RNAi載體。
【作者單位】： 湖南農業(yè)大學園藝園林學院/國家柑橘改良中心長沙分中心;
【基金】：國家自然科學基金(30900972,3157211) 國家公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201203076-06) 湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(CX2013B290)
【分類號】：S436.66
【正文快照】： Construction and Transformation of RNAi Vector forCitrus tristeza virus Gene p23LI Fang,DENG Zi-niu,ZHAO Ya,LI Da-zhi,DAI Su-ming(Horticulture and Landscape College,Hunan Agricultural University/National Center for Citrus Improvement(Changsha),Changsha 4

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王盛;王楊;李志英;張虹;雒麗娜;董潔;王玉炯;;TBSV病毒瞬時表達載體構建及其表達[J];寧夏大學學報(自然科學版);2011年02期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 樊磊;小菜蛾顆粒體病毒瞬時表達實驗系統(tǒng)的構建及其晚期表達因子在非受納細胞系Sf-9中的功能分析[D];華中師范大學;2011年

，

本文編號：1248394