發(fā)布時(shí)間：2017-11-15 00:15

  本文關(guān)鍵詞：干旱脅迫下發(fā)菜固氮酶基因（nifH、nifD、nifK）的差異表達(dá)與基因克隆

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【摘要】：發(fā)菜是一種陸生固氮藍(lán)藻,主要分布于干旱、半干旱荒漠草原地區(qū),是當(dāng)?shù)刂饕纳锕痰Y源和拓荒植物。固氮酶由固氮基因nif礦編碼,在鉬鐵固氮酶系統(tǒng)中,nifH基因編碼鐵蛋白,nifD基因和nifK基因編碼鉬鐵蛋白。本研究通過(guò)qRT-PCR技術(shù),分析不同干旱脅迫下發(fā)菜固氮酶基因nifH、nifD、nifK在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化；根據(jù)同源物種設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性和特異性引物,克隆nifH、 nifD、nifK基因全長(zhǎng),研究其原核表達(dá)并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：(1)發(fā)菜固氮酶nifH、nifD和nifK基因隨藻體含水量的逐漸降低,基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量呈逐漸增加；(2)根據(jù)簡(jiǎn)并性引物和特異性引物克隆獲得長(zhǎng)度為894 bp的nifH基因,GenBank登陸號(hào)為Banklt1901364 (KU886163);1443 bp的nifD基因,GenBank登陸號(hào)為BankIt1901385(KU886164)；1536 bp的nifK基因, GenBank登陸號(hào)為BankIt1901391 (KU886165);(3)將nifH、nifD和nifK基因在大腸桿菌中表達(dá),分別獲得一個(gè)約36kD、57 kD、和58 kD的外源蛋白；(4)生物信息學(xué)分析表明：①nifH、nifD和nifK核苷酸序列和氨基酸序列均具有較高的保守性；②nifH在第240位的丙氨酸親水性最強(qiáng),第273位的谷氨酸疏水性最強(qiáng)：nifD在第28位的賴氨酸親水性最強(qiáng),第359位的蛋氨酸疏水性最強(qiáng)；nifK在第51位的酪氨酸親水性最強(qiáng),第76位的苯丙氨酸疏水性最強(qiáng)；③nifH蛋白的Ser有4個(gè)磷酸化位點(diǎn)、Thr有3個(gè)磷酸化位點(diǎn)和Tys有2個(gè)磷酸化位點(diǎn)；nifD蛋白的Ser有12個(gè)磷酸化位點(diǎn),Thr有10個(gè)磷酸化位點(diǎn),Tys有6個(gè)磷酸化位點(diǎn)；nifK蛋白的Ser有15個(gè)磷酸化位點(diǎn),Thr有8個(gè)磷酸化位點(diǎn),Tys有6個(gè)磷酸化位點(diǎn)。④nifH、nifD和nifK蛋白均為膜外蛋白。nifH、nifD、nifK基因編碼的蛋白,二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由a螺旋、隨機(jī)卷曲、折疊和轉(zhuǎn)角構(gòu)成。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果,nifH、nifD、nifK序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中X晶體衍射結(jié)構(gòu)相似度分別為52%、70%和55%。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究發(fā)菜固氮酶基因的分子結(jié)構(gòu)和發(fā)菜響應(yīng)干旱脅迫的固氮機(jī)理及氮代謝過(guò)程奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2

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