本文關鍵詞：棉花（Gossypium hirsutum）PYL基因的分離與鑒定

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【摘要】：棉花是非常重要的經濟作物之一,在世界各地都有種植。棉花的主產品棉纖維是一種天然的紡織纖維,是紡織工業(yè)的重要原材料。在棉花生長發(fā)育中,常常出現(xiàn)一些不利的環(huán)境條件,例如干旱、水澇、低溫、高鹽等。這些不利的環(huán)境因素嚴重影響棉花正常生長,造成減產減收。如何提高棉花品種對上述不良環(huán)境的抗性是目前各國研究人員關注的問題,其中通過轉基因技術向棉花基因組中引入新的抗逆基因是一種非常具有前景的策略。脫落酸(ABA)是一種植物激素,ABA核心信號通路在植物對非生物脅迫的應答中發(fā)揮關鍵作用。ABA受體PYL蛋白、負調控因子A類PP2C蛋白、正調控因子SnRK2s蛋白和下游的效應因子共同組成了一條完整的ABA核心信號通路。對棉花中編碼這些蛋白的基因進行克隆鑒定和功能研究,有助于更好地理解棉花ABA信號通路,從而為棉花抗逆基因的篩選鑒定提供線索。本文在棉花基因組中分離了27個編碼棉花ABA的受體PYL蛋白的基因,命名為GhPYLl-27,對這些PYL基因及其編碼蛋白進行了序列與進化分析、組織表達和脅迫誘導表達分析,以及它們與PP2C蛋白的相互作用及轉基因擬南芥表型分析等,主要結果如下：1、棉花PYL基因的分離鑒定和序列結構及進化分析依據與擬南芥PYL蛋白的序列相似性,我們從棉花基因組中分離了27個GhPYL基因,這些基因的ORF長約600bp,編碼的氨基酸數目在200個左右,在一些二級結構上非常保守。依據與擬南芥PYL蛋白的同源性可將其分為三個亞組。2、棉花PYL基因的組織表達和脅迫誘導表達分析分析了其中9個GhPYL基因在棉花組織中的表達譜,結果顯示它們具有不同的組織表達模式。GhPYL1在根、下胚軸、子葉中的表達量相對較高,GhPYL8、 GhPYL12在根中強烈表達,而GhPYL26在各組織中表達量相差不大。利用定量RT-PCR技術對5個棉花PYL基因(GhPYLl、GhPYL8、GhPYLl0、GhPYL12和GhPYL26)的表達進行了定量分析,研究它們是否在干旱脅迫下誘導表達,結果顯示在晉棉13號受到干旱脅迫后,這5個GhPYL基因均出現(xiàn)了下調表達。3、棉花PYL蛋白與PP2C蛋白在酵母中的相互作用將GhPYL基因構建到AD載體,GhPP2C基因構建到BD載體,轉化酵母進行酵母雙雜交實驗,結果表明GhPYL8、GhPYL10、GhPYL12、GhPY22、GhPYL25和GhPYL26蛋白能夠與棉花PP2C蛋白在酵母中發(fā)生相互作用,并且這種相互作用具有選擇性。4、GhPYL1蛋白的亞細胞定位分析構建GFPrGhPYL1融合蛋白表達載體,通過農桿菌介導的方法轉化擬南芥,獲得轉基因植株。在共聚焦顯微鏡下觀察轉基因擬南芥幼苗根部細胞,發(fā)現(xiàn)GFP應該主要分布在細胞質與細胞核中,這表明GhPYLl蛋白定位于細胞質和細胞核。5、過量表達GhPYL轉基因擬南芥對ABA的敏感性分析構建GhPYL10、GhPYL12、GhPYL26的過量表達載體,通過農桿菌介導的方法轉化擬南芥,獲得轉基因株系。統(tǒng)計野生型和轉基因擬南芥在含ABA的MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率和綠苗率發(fā)現(xiàn),3個GhPYL基因的轉基因擬南芥相比野生型均萌發(fā)更慢,幼苗生長受到ABA更嚴重的抑制,說明過量表達GhPYLs增加了擬南芥在種子萌發(fā)和幼苗生長時期對ABA的敏感性。6、過量表達GhPYL轉基因擬南芥對NaCl的敏感性分析統(tǒng)計野生型和GhPYL10、GhPYL12、GhPYL26的轉基因擬南芥在含NaCl的MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率和綠苗率發(fā)現(xiàn),過量表達GhPYL10和GhPYL12轉基因擬南芥萌發(fā)率和綠苗率比野生型更低,而過量表達GhPYL26轉基因擬南芥萌發(fā)率低于野生型。7、過量表達GhPYL轉基因擬南芥對甘露醇的敏感性分析統(tǒng)計野生型和GhPYL10、GhPYL12、GhPYL26的轉基因擬南芥在含甘露醇的MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率和綠苗率,結果顯示野生型和轉基因擬南芥的的萌發(fā)率和綠苗率沒有顯著差異。8、過量表達GhPYL轉基因擬南芥的根長分析統(tǒng)計野生型和GhPYL10、GhPYL12、GhPYL26轉基因擬南芥在MS培養(yǎng)基上生長10天后的主根長度,發(fā)現(xiàn)過量表達GhPY12和GhPYL26轉基因擬南芥主根長度比野生型更長,而過量表達GhPYL10轉基因擬南芥主根長度與野生型無顯著差異,說明過量表達GhPYL12和GhPYL26能促進擬南芥幼苗時期主根的生長發(fā)育。
【學位授予單位】：華中師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;S562

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