本文關鍵詞：重組大腸桿菌多基因串聯(lián)表達合成反式-4-羥基-L-脯氨酸

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【摘要】：[目的]得到表達多個基因的重組大腸桿菌,以期實現(xiàn)葡萄糖為碳源生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸。[方法]以菌液為模板,PCR得到不同來源的proB、proA、proC、p4h基因,重疊PCR串聯(lián)相鄰基因,所得片段通過無縫組裝與p ET-28a載體連接,并在大腸桿菌BL21中表達,篩選陽性表達菌株,電泳及測序驗證,重組菌在30 ml MCG培養(yǎng)基搖瓶中發(fā)酵,分光光度法和HPLC檢測產(chǎn)量。[結果]0.5 mmol/L IPTG誘導24 h,5組串聯(lián)基因成功在大腸桿菌中表達,并以葡萄糖為碳源,獲得產(chǎn)物反式-4-羥基-L-脯氨酸,培養(yǎng)基不添加L-脯氨酸時E.coli BL21/p ET-28a-BAHHbs、E.coli BL21/p ET-28a-HBACkp和E.coli BL21/p ET-28a-HBAmg產(chǎn)量達到0.28 g/L、0.16 g/L和0.29 g/L,添加4 mmol/L的L-脯氨酸時,分別為0.64 g/L、0.55 g/L和0.74 g/L。[結論]proB、proA、proC及p4h基因成功在大腸桿菌中表達,5株重組菌在30℃搖瓶中誘導表達24 h得到產(chǎn)物反式-4-羥基-L-脯氨酸,其中E.coli BL21/p ET-28a-HBAmg產(chǎn)量達到0.74 g/L,為今后在發(fā)酵罐中生產(chǎn)奠定基礎。
【作者單位】： 華東理工大學生物工程學院生物反應器工程國家重點實驗室;
【關鍵詞】： 重組大腸桿菌 重疊PCR 無縫組裝 反式--羥基-L-脯氨酸
【分類號】：Q78
【正文快照】： 反式-4-羥基-L-脯氨酸(Trans-4-hy-droxy-L-proline,Hyp),簡稱羥脯氨酸,是重要的前體物質(zhì),可用于藥物[1]、化妝品[2]、飼料添加劑[3]等的合成。Hyp可從水解膠原蛋白中獲得[4],但是該步驟復雜,而且會產(chǎn)生大量廢物[5]�；瘜W合成法底物利用率很低[6]。微生物中的脯氨酸羥化酶(pro

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