本文關(guān)鍵詞：過(guò)表達(dá)AtTIP和AtNHX基因?qū)M南芥耐鹽性的影響

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【摘要】：通過(guò)基因工程手段培育耐鹽作物是開(kāi)發(fā)鹽堿地的重要途徑,前人及本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn),耐鹽性較強(qiáng)的真鹽生植物在鹽漬條件下Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和液泡膜水孔蛋白的基因表達(dá)量均顯著升高。因此,推測(cè)這兩類基因可能都參與了植物的鹽脅迫響應(yīng)。本文通過(guò)在擬南芥中過(guò)表達(dá)1個(gè)液泡膜水孔蛋白(tonoplast intrinsic proteins,At TIP1-1)和2個(gè)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+/H+exchanger,At NHXs)基因,比較了它們?cè)谥参锬望}性中的作用,研究結(jié)果如下。1 At NHX1、At NHX2、At TIP1-1基因克隆及擬南芥轉(zhuǎn)化利用RT-PCR方法克隆At TIP1-1、At NHX1和At NHX2基因CDS序列。以p CAMBIA-35s-OCS和p Cambia1300-221-HA-MYC為載體骨架,構(gòu)建基因過(guò)量表達(dá)載體,然后將構(gòu)建的表達(dá)載體在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下利用浸滲花蕾法轉(zhuǎn)化擬南芥。對(duì)卡那霉素抗性和潮霉素抗性的植株利用PCR檢測(cè)和熒光定量PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株均可正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)目的基因。2轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同鹽濃度下的形態(tài)分析當(dāng)轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型萌發(fā)至兩天時(shí),分別轉(zhuǎn)移到含有0、50、100、150和200 m M Na Cl的MS方板培養(yǎng)基上。待長(zhǎng)至7天后,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)At NHX1和At NHX2的擬南芥株系在100-200 m M Na Cl濃度下,長(zhǎng)勢(shì)均好于野生型。而轉(zhuǎn)At TIP1-1的擬南芥株系在150-200 m M Na Cl下長(zhǎng)勢(shì)均不如野生型,即表現(xiàn)出鹽敏感。而其它鹽濃度下轉(zhuǎn)基因植株和野生型并沒(méi)有明顯區(qū)別。3轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽處理下的生理生化分析當(dāng)轉(zhuǎn)基因擬南芥生長(zhǎng)至6葉期時(shí),用100 m M和200 m M Na Cl進(jìn)行鹽處理,兩周之后,測(cè)定葉綠素?zé)晒狻⑷~綠素含量、植株鮮重以及蛋白質(zhì)含量等生理指標(biāo)。結(jié)果也顯示,轉(zhuǎn)At NHX1和At NHX2的擬南芥株系鹽處理后整株鮮重、葉綠素含量和葉片光合活性均高于野生型,耐鹽性顯著提高,說(shuō)明這兩個(gè)基因均在擬南芥耐鹽性中具有重要作用。而單獨(dú)過(guò)表達(dá)At TIP1-1不能提高擬南芥的耐鹽性,甚至使擬南芥對(duì)鹽脅迫更敏感,說(shuō)明液泡膜水孔蛋白參與植物耐鹽性可能是與NHX基因協(xié)同作用的,二者的協(xié)同作用將在今后的工作中進(jìn)一步證明。
【關(guān)鍵詞】：擬南芥 Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 液泡膜水孔蛋白 鹽脅迫 耐鹽性
【學(xué)位授予單位】：曲阜師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 縮略詞6-9
• 第1章 文獻(xiàn)綜述9-17
• 1.1 鹽堿地開(kāi)發(fā)利用方式與植物耐鹽性9
• 1.2 植物的耐鹽機(jī)制9-11
• 1.2.1 Na~+區(qū)域化與植物耐鹽性10
• 1.2.2 Na~+/ K~+平衡與植物耐鹽性10
• 1.2.3 滲透保護(hù)物質(zhì)積累與植物耐鹽性10
• 1.2.4 抗氧化能力與植物耐鹽性10-11
• 1.3 耐鹽性研究存在的問(wèn)題及解決方案11-16
• 1.3.1 真鹽生植物的特征11-12
• 1.3.2 真鹽生植物耐鹽的分子機(jī)制12
• 1.3.3 Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與水孔蛋白簡(jiǎn)介12-13
• 1.3.4 Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與水孔蛋白的基本結(jié)構(gòu)13
• 1.3.5 Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與水孔蛋白的表達(dá)模式13-15
• 1.3.6 Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與水孔蛋白的功能15-16
• 1.4 展望16-17
• 第2章 材料與方法17-24
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料17
• 2.1.1 植物材料17
• 2.1.2 質(zhì)粒載體及菌種17
• 2.1.3 主要分子生物學(xué)試劑17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法17-24
• 2.2.1 核酸提取17-18
• 2.2.2 TIP1-1、NHX1及NHX2的克隆18-20
• 2.2.3 擬南芥超表達(dá)載體構(gòu)建20-21
• 2.2.4 轉(zhuǎn)化擬南芥21
• 2.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選21
• 2.2.6 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株21
• 2.2.7 轉(zhuǎn)基因植株的目的基因拷貝數(shù)的檢測(cè)21
• 2.2.8 轉(zhuǎn)基因植株在不同鹽濃度處理下的幼苗期形態(tài)分析21-22
• 2.2.9 轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下的葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)分析22
• 2.2.10 轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽處理下鮮重的測(cè)定22
• 2.2.11 轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽處理下葉綠素含量的測(cè)定22-23
• 2.2.12 轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽處理下蛋白質(zhì)含量的測(cè)定23-24
• 第3章 結(jié)果與分析24-41
• 3.1 擬南芥TIP1-1、NHX基因編碼區(qū)克隆及轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建24-25
• 3.1.1 擬南芥總RNA提取及檢測(cè)24
• 3.1.2 三種基因克隆及測(cè)序24-25
• 3.2 表達(dá)載體構(gòu)建25-26
• 3.2.1 PMD18-T-基因以及空載體的雙酶切25
• 3.2.2 菌落PCR及雙酶切檢測(cè)25
• 3.2.3 農(nóng)桿菌菌落PCR25-26
• 3.3 轉(zhuǎn)基因植株篩選26-27
• 3.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR檢測(cè)27-30
• 3.4.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR驗(yàn)證27-28
• 3.4.2 轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)的驗(yàn)證28-29
• 3.4.3 目的基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量29-30
• 3.5 鹽處理對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的影響30-41
• 3.5.1 鹽處理對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的影響30-34
• 3.5.2 正常條件和鹽處理下對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的形態(tài)影響變化34-35
• 3.5.3 鹽處理對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)的影響35-36
• 3.5.4 鹽處理對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥鮮重的影響36-37
• 3.5.5 鹽處理對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素含量的影響37-38
• 3.5.6 鹽處理對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥蛋白質(zhì)含量的影響38-41
• 第4章 討論41-44
• 4.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同鹽處理下的幼苗形態(tài)分析41-42
• 4.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽處理下的生理生化分析42-44
• 4.2.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥在低鹽濃度下的生理分析42-43
• 4.2.2 轉(zhuǎn)基因植株在高鹽濃度下的生理分析43-44
• 第5章 結(jié)論與展望44-45
• 參考文獻(xiàn)45-52
• 致謝52-53
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果53

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1 劉倩;過(guò)表達(dá)AtTIP和AtNHX基因?qū)M南芥耐鹽性的影響[D];曲阜師范大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1114227